约氏疟原虫MIF分子调节巨噬细胞炎性因子基因表达

约氏疟原虫MIF分子调节巨噬细胞炎性因子基因表达
邵丁丁;曾山;钟翔;王恒
【摘要】Objective Plasmodium derived macrophage migration inhibitory factor (MIF) ortholog was belived to have potential for regulating host immune cell. Plasmodium yoelii derived MIF (PyMIF) has highly conserved crystal structure and similar bioactivity as host mouse MIF. However, the regulatory mechanism is not clear so far. Here, we report the regulation of PyMIF on host inflammatory cytokines transcription in macrophage, and the compared analysis of regulation activity between PyMIF and host mouse MIF (MmMIF). Methods Both PyMIF and MmMIF were expressed and purified as recombinant proteins and were removed the endotoxin by C8 reversed-phase column. Then the endotoxin-free protein was added to cultured mouse monocyte / macrophage cell line RAW264. 7. After incubation, the total RNA was extracted and applied to "RT2 ProfilerTM PCR Array Mouse Inflammatory Cytokines & Receptors" analysis. Results PyMIF significantly up-regulated 17 inflammatory cytokine genes transcription level and down-regulated 3 genes (CCR6、CCR8 and ILIF6) transcription. The regulated gene quantity by PyMIF was more than MmMIF. Most genes regulated by PyMIF were involved in a Th2 response bias or in expanding inflammatory response. Conclusion There is significant difference between PyMIF and MmMIF in regulating host macrophage activity . These results provided more information about Plasmodium MIF function on host immune cell, and will facilitate the deep
understanding of Plasmodium MIF during infection.%目的分析约氏疟原虫表达的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)对小鼠巨噬细胞炎性因子基因表达的调节情况,并比较PyMIF和宿主小鼠MIF(MmMIF)在调节炎性因子表达水平方面的差异.方法亲和柱纯化原核表达的带His标签的重组MIF蛋白,去除内毒素后刺激体外培养的同步化小鼠单核巨噬细胞系,随后纯化高质量的RNA,通过小鼠炎性因子和受体芯片进行分析.结果 PyMIF显著促进了17个炎性因子和炎性因子受体基因的转录(ΔΔCt≥2),同时显著降低了3个基因(CCR6、CCR8和IL1F6)的转录水平(ΔΔCt≤-2).并且,PyMIF调节的基因数量明显多于MmMIF.结论 PyMIF和MmMIF对巨噬细胞的活性调节存在显著差异,此结果为进一步了解PyMIF对宿主炎性反应的作用提供了重要数据.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2011(031)007
【总页数】5页(P746-750)
【关键词】巨噬细胞迁移抑制因子;疟原虫;基因芯片;炎性因子
【作者】邵丁丁;曾山;钟翔;王恒
【作者单位】中国医学科学院,基础医学研究所,医学微生物及寄生虫学系,北
京,100005;中国医学科学院,基础医学研究所,医学微生物及寄生虫学系,北
京,100005;中国医学科学院,基础医学研究所,医学微生物及寄生虫学系,北
京,100005;中国医学科学院,基础医学研究所,医学微生物及寄生虫学系,北
京,100005
【正文语种】中文
【中图分类】R382
巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种
多效性细胞因子，在多种感染性疾病和免疫相关疾病中发挥重要作用，如能够抑制红系的分化、血红蛋白产生以及抑制造血功能等［1－2］。

多种寄生虫表达的
MIF同源分子先后在线虫［3］、钩虫［4］、艾美儿球虫［5］、利氏曼原虫［6］和疟原虫［7－10］中被发现，它们均被证明与高等动物宿主的MIF在高级结构
和功能上具有惊人的一致性，说明这个基因在上亿年的进化中都是非常保守的。

尽管目前对寄生虫MIF的研究工作取得一定进展，但其生物学意义目前尚未得到证实。

本研究利用炎性因子芯片，研究约氏疟原虫MIF(P．yoelii MIF，PyMIF)对小鼠巨噬细胞炎性细胞因子基因表达的影响，并比较分析疟原虫MIF和宿主小鼠
MIF(mouse MIF，MmMIF)作用的差异。

1 材料与方法
1.1 重组蛋白的表达和纯化以及内毒素去除
本实验室构建的带His标签的PyMIF-pET30a和MmMIF-pET30a原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达为可溶性的 PyMIF-His和MmMIF-His蛋白(IPTG
浓度0.625 mmol/L)，经Ni-NTA(Invitrogen公司)纯化后，通过Sep-Pak C8 column(Waters公司)柱去除内毒素，并送中国药品生物制品标准化研究中心鲎试剂法鉴定LPS(内毒素)含量，2种蛋白的LPS含量均小于0.05 EU/mL。

1.2 酶活性检测
2μg的MIF重组蛋白溶于50μL蛋白缓冲液(0.435 mol/L硼酸，pH 6.2)中，同时加入现配的50μL底物溶液(50 mmol/L、pH 6.0的醋酸铵溶液，含终浓度为1 mmol/L对羟甲基苯丙酮酸)，立即检测120 s内330 nm条件下光吸收值的变化
并绘制曲线。

1.3 细胞培养和样本制备
小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7(来自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)以每孔1×106个细胞接种在细胞培养用6孔板内，并在含10%进口胎牛血清和谷胺酰胺 (2 mmol/L)的高糖DMEM完全培养基和37℃、5%CO2条件下培养16 h，然后将培养基替换成含0.5%血清的DMEM中继续培养24 h。

分别加入低内毒素的PyMIF蛋白(终浓度100 ng/mL)、MmMIF蛋白 (终浓度100 ng/mL)以及低内毒素的蛋白缓冲液 (PBS，作为对照)，10 h后吸去培养基，并加入Trizol覆盖各
孔细胞，5 min后镜下观察细胞已全部裂解，完全吸出孔内细胞，立即用干冰保存。

随后用Trizol抽提RNA，再用DNase I消化RNA样品，去除其中可能含有的基
因组DNA，然后用RNeasy®MinEluteTM纯化试剂盒 (Qiagen公司)纯化所得RNA，最后用紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和纯度。

1.4 芯片杂交
“小鼠炎性因子和受体芯片［RT2 ProfilerTM PCR Array Mouse Inflammatory Cytokines＆ Receptors(APMM-011A)］”由上海康成生物公司从美国SuperArray公司订购，芯片为Real time PCR芯片，每张芯片包括84个炎性因
子及其受体基因，5个管家基因，以及7个阴性和阳性对照。

RNA反转录合成cDNA，在 ABI PRISM7700仪器上进行 Real-time PCR。

随后完整的RNA样本
与Real-time PCR芯片杂交。

本芯片的管家基因包括:β葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase beta，GUSB)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase 1，HPRT1)，胞质α 热休克蛋白 90B1［heat shock protein
90kDa alpha(cytosolic)，class B member 1，HSP90aB1］，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，胞质β肌动蛋白(actin beta cytoplasmic，ACTb)。

除管家基因外，其余84个炎性反应相关基因包括:ABC结合蛋白F1(ABCF1)，B-cell leukemia/lymphoma 6 (BCL6)，burkitt lymphoma receptor1(BIR1)，补体组分 C3，caspase 1(CASP1)，C 反应蛋白(CRP)，C趋化因子受体1(XCR1)，CC趋化因子家族 (CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL6，CCL7，CCL8，CCL9，CCL12，CCL17，CCL19，CCL20，CCL22，CCL24和 CCL25)，CC趋
化因子受体 1-9，CX3C趋化因子1，CXC趋化因子(CXCL1，CXCL4，CXCL5，CXCL9， CXCL10， CXCL11， CXCL12，CXCL13和 CXCL15)，IFNγ，白细胞
介素(IL-1A，IL-1B，IL-1F6，IL-1F8，IL-3，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17B，IL-18 和 IL-20)，白细胞介素受体(IL-1R1，IL-1R2，IL-2Rb，
IL-2Rg，IL-5Ra，IL-6Ra，IL8Rb，IL-10Ra，IL-10Rb 和 IL-13Ra1)，IL6ST(Il6 signal transducer)，整合素αM(intergrin alpha M，ITGam)，整合素
β2(integrin beta 2，ITGb2)，淋巴毒素 A(lymphotoxin A，LTA)、
B(lymphotoxin B，LTB)，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，可诱导细胞因子亚家族
E(small inducible cytokine subfamily E，SCYE1)，分泌磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein 1，SPP1)，TGFβ1，TNF，TNF 受体 1a(TNF receptor 1a)、
1b(TNF receptor 1b)，CD40 配体(CD40L)，Toll相互作用蛋白(TOLLIP)
1.5 统计学分析
1.5.1 采用ΔΔCt方法计算处理组中每个炎性因子或受体基因的
ΔCt:ΔCt(MmMIF)=MmMIF实验组的炎性因子或受体基因Ct－管家基因Ct平均值;ΔCt(PyMIF)=PyMIF实验组的炎性因子或受体基因Ct－管家基因Ct平均
值;ΔCt(PBS)=阴性对照组的炎性因子或受体基因Ct－管家基因Ct平均值。

1.5.2 采用ΔΔCt方法计算实验组与对照组中每个基因的
ΔΔCt:ΔΔCt(MmMIF)=ΔCt(MmMIF)－ΔCt(PBS);ΔΔCt(PyMIF)= ΔCt(PyMIF)－
ΔCt(PBS)。

2 结果
2.1 去除内毒素后PyM IF和MmM IF的互变异构酶活性
原核表达的2种rMIF经C8柱去除内毒素后，分别检测其酶活性，结果显示，PyMIF和MmMIF都具有MIF家族典型的酮式-烯醇氏互变异构酶活性(图1)，而且疟原虫来源的MIF(PyMIF)酶活性低于宿主MIF(MmMIF)的酶活性，这与前期的实验结果是一致的［10］。

酶活性结果提示，去除内毒素的两种MIF可用于细胞学实验研究。

2.2 RNA纯化及质量鉴定
分别用蛋白 Buffer、MmMIF及 PyMIF处理RAW264.7细胞得到3组RNA，其琼脂糖电泳结果如图2所示。

3组RNA的OD260/OD280比值分别为1.96(缓冲液)、1.99(MmMIF)和 1.96(PyMIF)，经DNAaseI消化后的OD260/OD280比值分别为2.16(缓冲液)、2.13(MmMIF)和2.12(PyMIF)。

图1 MmM IF和PyM IF的互变异构酶活性Fig 1 Tautomerase activity of PyM IF and MmM IF
图2 RNA琼脂糖电泳图Fig 2 RNA agarose gel electrophoretogram PBS.cell treated by buffer;MmMIF.cell treated by MmMIF;PyMIF.cell treated by PyMIF
2.3 芯片结果和分析
本芯片共89条基因，其中5条为管家基因，实验结果显示管家基因的转录水平在各组之间无显著变化(表1)。

通过分析芯片中84种分子的水平变化发现，与蛋白缓冲液对照组比较总共有24个基因的转录水平发生显著变化。

其中PyMIF显著上调(ΔΔCt≥2)了17个基因的转录水平，同时显著下调(ΔΔCt≤－2)了3个基因转录水平;MmMIF上调10个基因的转录水平(表2)。

PyMIF相比MmMIF明显调节了更多炎性相关因子。

具体结
果是:PyMIF显著促进了ABCF1、C3、CCL7、CCL17、CCL22、CXCL11、IL10、IL13、IL18、IL1b、IL6ST、LTA、XCR1 等炎性因子和CCR2、CCR3、IL13Ra1、IL2Rg 等炎性因子受体基因的转录;并下调CCR6、CCR8和IL1F6基因转录。

其中对 CCL7、CCL17、CCL22、CCR3、CCR8 和 XCR1 的调节作用更为显著
(ΔΔCt≥3或ΔΔCt≤ －3)。

MmMIF 显著促进 CCL6、CCL7、CCL12、CCL24、CCR3、CCR9、IL10、IL13、IL6ST、LTA 等基因转录水平。

其中对CCL7、
CCR3的调节最为显著(ΔΔCt≥3)。

而值得注意的是，对于 TNF、TGFβ1、IFNγ、CD40等疟疾感染相关的主要炎性因子，PyMIF和MmMIF对其并没有调节作用。

除此之外，在后期分析中，以MmMIF组为对照，将PyMIF组实验数据与MmMIF组相比，所得 PyMIF/MmMIF值＞2.0的被认为该基因转录水平在二者之间存在显著差异。

结果显示，PyMIF较MmMIF相比，显著上调了CCL17和CCL22两个基因转录。

表1 小鼠炎性因子和受体芯片结果(管家基因部分)Table 1 Result ofmouse inflammatory cytokines＆receptors genechip(house-keeping genes)symbol description ΔΔCt PyMIF ΔΔCt MmMIF GUSB glucuronidase，beta 1.42 1.04 HPRT1 hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase 1 1.55 1.26 HSP90aB1 heat shock protein 90 ku alpha(cytosolic)，class Bmember 1－1.01 －1.01 GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1.04 1.02 ACTb actin，beta，cytoplasmic －1.03 －1.01
表2 小鼠炎性因子和受体芯片结果(差异表达基因部分)Table 2 Result ofmouse inflammatory cytokines＆recep tors genechip(differential expression genes)symbol description ΔΔCt PyMIF ΔΔCt MmMIF ABCF1 ATP-binding cassette，sub-family F(GCN20)，member 1 2.07 C3 complement component3 2.16 CCL6 chemokine(C-Cmotif)ligand 6 2.03 CCL7
chemokine(C-Cmotif)ligand 7 3.56 4.35 CCL12 chemokine(C-
Cmotif)ligand 12 2.75 CCL17 chemokine(C-Cmotif)ligand 17 4.56 CCL22 chemokine(C-Cmotif)ligand 22 3.25 CCL24 chemokine(C-Cmotif)ligand 24 2.45 CCR2 chemokine(C-Cmotif)receptor 2 2.53 CCR3 chemokine(C-Cmotif)receptor 3 3.61 3.76 CCR6 chemokine(C-Cmotif)receptor 6 －2.27 CCR8 chemokine(C-Cmotif)receptor 8 －3.25 CCR9 chemokine(C-Cmotif)receptor 9 2.25 CXCL11 chemokine(C-X-Cmotif)ligand 11 2.53
IL10 interleukin 10 2.22 2.19 IL13 interleukin 13 2.13 2.75 IL13Rα1 interleukin 13 receptor，alpha 1 2.01 IL18 interleukin 18 2.04 IL1b interleukin 1 beta 2.39 IL1F6 interleukin 1 family，member 6 －2.06 IL2Rγ interleukin 2 receptor，gamma chain 2.23 IL6ST interleukin 6 signal transducer 2.68 2.11 LTA lymphotoxin A 2.22 2.60 XCR1
chemokine(Cmotif)receptor 1 3.12
3 讨论
疟原虫MIF已经被证明在疟原虫感染后被分泌或释放进入宿主循环系统，并且在感染疟疾的小鼠或非复杂性疟疾(uncomplicated malaria)患者外周血中，疟原虫MIF的浓度与虫血率以及疾病严重程度成显著正相关［11］。

因此，疟原虫MIF 被推测具有调节宿主免疫系统的能力。

巨噬细胞已经被证实是疟原虫 MIF 的靶细胞［10，12］，本研究利用生物芯片，进一步探讨PyMIF对巨噬细胞炎性因子基因的调节情况。

芯片结果显示，PyMIF调控了巨噬细胞内多种炎性相关基因的转录水平，其中绝大多数为上调作用，提示PyMIF能够促进宿主小鼠巨噬细胞的炎性反应。

并且，PyMIF相比MmMIF明显调节了更多炎性相关因子的转录，这与本实验之前在信号通路基因芯片上所看到的结果类似。

在信号通路基因芯片检测结果中，PyMIF调节了16个基因的转录水平，而MmMIF仅改变2个基因的转录
水平。

本实验前期在动物免疫实验中，也观察到PyMIF免疫的新西兰大白兔或Balb/c小鼠，出现明显的免疫位点局部强炎性反应而发生溃烂、或者出现脾的异
常增大等现象，而同批次免疫MmMIF的动物并没有出现此类反应(结果未发表)。

以上这些结果都提示PyMIF可能是一个比MmMIF更强的免疫反应诱导分子。

在炎性因子和受体芯片中，PyMIF上调的趋化因子及受体基因包括多个CC家族
趋化因子及受体，而这些趋化因子和受体多为Th2倾向的，例如CCR3，CCL17，CCL22;此外还包括参与巨噬细胞募集的CCR2。

这些基因转录水平的升高，提示PyMIF可能与疟原虫感染后免疫反应向Th2反应发展相关。

MmMIF所诱导的巨
噬细胞也表现为CCR3显著升高，但与PyMIF不同的是，MmMIF对CCL17和CCL22并没有调节效应。

此外，PyMIF和MmMIF显著上调CCL7基因转录(2－ΔΔCt值分别为3.56和4.35)，CCL7又名单核细胞趋化蛋白3(monocyte chemotactic protein 3，MCP-3)，主要参与单核-巨噬细胞的趋化，提示两种MIF都可诱导巨噬细胞趋化活性。

综上所述，PyMIF分子和MmMIF分子都能活化小鼠巨噬细胞、促进炎性反应效应，而虫源MIF分子在一些方面具有更高的效应，本实验结果有助于理解虫源
MIF分子在感染过程中的作用机制，并对虫源MIF的研究提供新的思路。

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