液相色谱提取维生素C
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3.2三份水果样品的液相色谱图
图2火龙果样品的HPLC谱图
图3猕猴桃的HPLC谱图
图4鸭梨的HPLC谱图
3.3样品相关数据及Vc含量的计算
实验测得的样品相关数据如表2所示。
表2样品的液相色谱数据与样品质量
样品名称
保留时间/min
峰面积
质量/g
火龙果
2.931
57115
5.0177
猕猴桃
2.964
462889
2.2实验步骤
2.2.1仪器准备
按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。
2.2.2样品准备
准确称取切碎的蔬果样品5.0g，以1mol/L乙酸50 mL为萃取溶剂，微波功率设为自动，萃取时间为10 min，萃取温度设定为50℃，平行萃取两次（本次实验只萃取1次）。萃取液过滤后用1mol/L乙酸溶液定容至100 mL，制成供试品溶液。
2.2.3定性分析
分别取10μL 50 mg/L的Vc标准溶液和供试品溶液，进HPLC分析。根据保留时间定性分析蔬果中的Vc。
2.2.4校准曲线绘制
分别配制5，20，50，80，100 mg/L的Vc样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定3次。以Vc色谱峰高对浓度作图，绘制校准曲线。
2.2.5定量分析
液相色谱法中常用的定性方法有用已知纯物质对照定性、用文献值进行定性分析、根据相对保留值定性、与其他方法联用定性（如与质谱联用）等方法。可根据峰面积或峰高进行定量分析，具体计算方法有归一化法、标准曲线法、内标法、标准加入法。
2、如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？
答：建立未知物的液相色谱方法应该考虑两个方面的因素，一方面是选择合适的色谱柱，色谱柱是液相色谱分析的核心组件，应根据分析对象的性质选取合适的色谱柱，如正向色谱、反向色谱和离子交换色谱等等；另一方面是流动相的选择，溶剂的极性是选择的重要依据，应该使用高纯度试剂做流动相，防止微量杂质长期积累和损坏色谱柱和使检测器噪声增加，同时应避免流动相与固定相发生作用使柱效下降或者损坏柱子，试样在流动相中应有适宜的溶解度防止沉淀在柱中积累还有流动相要满足检测器需求。
[4]刘燕德，周延睿，潘圆媛.基于最小二乘支持向量机的辣椒可溶性固形物和维生素C含量近红外光谱检测.《光学精密工程》, 2014, 22(2):281-288
[5]唐敏，赵健茗，张玉，喻菊洪，段玲利.三种水果中维生素C含量的HPLC法测定与比较.《食品与发酵科技》, 2014, 50(4):53-55
5.0002
鸭梨
2.976
13262
5.0015
将各样品的峰面积作为y代入线性方程y =32600x-44230，可求出各样品中Vc的浓度，并进一步计算该样品中Vc的含量，记于表3。
表3水果样品中Vc浓度与含量
样品名称
Vc浓度/mg·L-1
Vc含量/(mg/100g)
火龙果
3.11
6.20
猕猴桃
15.56
3、微波辅助萃取法为何能达到快速高效的萃取效果？
答：微波具有穿透到物质内部的本质，穿透的深度一般是从几毫米到几十厘米的范围，随频率不同而异。所以除了极大的物体外，微波能做到被加热的物体里外同时加热，这就大大缩短了加热时间，微波的这种加热速度快、均匀特点使得在用微波辅助提取技术时，消耗的时间和原料、试剂量都有显著的减少。
供试品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。平行测定2次，记录其Vc的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中Vc的含量，结果以mg/100g表示。
3实验结果
3.1标准曲线的绘制
表1Vc标准样品的高效液相色谱数据
CVc/mg·L-1
保留时间/min
峰面积
5
3.039
150647
20
2.910
除鸭梨外，火龙果和猕猴桃的谱图都较为理想。鸭梨的谱图有很多杂峰，而且有几个峰与Vc的峰强度相当甚至大于其强度。虽然有很多杂峰，但根据系列标准Vc溶液保留时间，我们可以从鸭梨的谱图上找到其中属于Vc的峰。但是，这些峰值都是负值，所以得出鸭梨的Vc含量十分可疑。理论上来说，就算是不含Vc的溶液（如流动相的溶液）的峰值也就为零，不会为负值。而出现负峰的原因可能有：1、检测器输出信号的极性相反；2、样品的吸收小于流动相，流动相不纯；3、样品溶剂干扰；4、示差折光检测器中样品的折射率较低；5、进样中带入气泡。
4思考和结论
4.1思考题
1、校准曲线法有何优缺点？液相色谱法中常用的定性定量方法有哪些？
答：校准曲线法优点：测定工作简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，适合大量样品的分析。
标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
31.12
鸭梨
1.76
3.52
如火龙果的峰面积为57115，代入标准曲线方程y =32600x-44230中，算得火龙果样品Vc浓度为C1= mg·L-1=3.11mg·L-1，故火龙果样品中的维生素C 。同理，猕猴桃样品Vc含量为31.12mg/100g，鸭梨样品Vc含量为3.52mg/100g（存疑）。
关键词微波辅助提取法高效液相色谱法标准曲线法维生素C含量
1引言
维生素C又称“抗坏血酸”，是人体健康所必需的13种维生素之一，能在体内各器官系统中发挥作用。它既能促进受伤血管壁的愈合，又是合成体内软骨素的重要原料，软骨素则能消除血管壁上附着的胆固醇和脂肪的积存，对血管有保护作用。它还能防治冠心病，预防消化道如食道、胃、直肠癌的发生。人体所需的维生素C，90％是从水果、蔬菜中获取的。我们日常食用的蔬菜和水果中，有许多含有丰富的维生素C[1]。
Vc标准溶液：快速准确称取0.025gVc，用1mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用1mol/L乙酸溶液定容，得到100mg/L标准溶液备用，现用现配。本次实验事先准备，不需配制。
2.1.3色谱条件
流动相：3%的乙腈-0.05mol/L KH2PO4水溶液（v/v）；流速1 mL/min；柱温30℃，紫外检测波长265 nm；进样量10μL。
4、试比较液相色谱法和气相色谱法的优缺点。
答：液相色谱法分离效率较气相色谱法低，需使用有机溶剂和价格昂贵的高压泵，价格和运行费用较高，优点是能分离和分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，其流动相可选用不同极性的液体效率高，费用低，故障率低，但只限于分析气体和沸点较低的化合物，适用面较窄，而且一般都要在较高温度下进行。
本实验采用微波辅助法，用1mol/L的乙酸萃取3组质量分别为5.3361g、5.3327g、5.3266g的火龙果，猕猴桃，鸭梨中的Vc，用高效液相色谱法进行分析测定。通过对比保留时间进行定性分析，以标准曲线法进行定量分析。由系列Vc标准溶液绘制峰面积对浓度的标准曲线，通过测定样品的峰面积，再由标准曲线得出样品Vc浓度，然后进一步计算样品Vc含量。实验测得火龙果，猕猴桃，鸭梨的Vc的含量分别为6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g。高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C含量，操作简单、分析速度快、灵敏度高、准确性高，试剂用量少等优点。
613936
50
2.918
1613201
80
2.937
2524154
100
2.946
3359268
以Vc标准系列溶液的色谱峰高对其浓度作图，经线性拟合得到如图1所示的校准曲线。
图1 Vc色谱峰高对浓度的标准曲线
由线性拟合得出色谱峰高对浓度的标准曲线方程为y =32600x-44230，相关系数为R² =0.9971。
2实验部分
2.1仪器与试剂
2.1.1仪器
高效液相色谱仪：LC-2010C（岛津香港有限公司）；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；色谱柱：依利特或PhenomenexC18柱(250 mm×4.6 mm, I.D.5μm)；平头进样器。
2.1.2试剂
乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；蔬果样品（火龙果，猕猴桃，鸭梨）。实验用水为超纯水。
4.2结论
本实验用微波辅助提取法以1mol/L乙酸萃取3组质量分别为5.0177g、5.0015g、5.0002g的不同水果样品中的Vc，用高效液相色谱法对其进行分析测定。由系列Vc标准溶液可得标准曲线方程y =32600x-44230，相关系数为R² =0.9971。将样品的Vc峰面积值代入标准曲线，可得出火龙果，猕猴桃，鸭梨Vc的浓度分别为3.11mg·L-1、15.56mg·L-1、1.76mg·L-1，含量分别为6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g。在实验过程中应该出现了问题，因为鸭梨的峰值都是负值，因鸭梨是最后一个测定的，故无法知道是仪器问题还是样品的问题。高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C含量，具有分析速度快、操作简单、灵敏度高、准确性高、试剂用量少等优点。
微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量
摘要本实验以微波辅助提取法，用1mol/L的乙酸萃取3组质量分别为5.0177g、5.0002g、5.0015g的火龙果，猕猴桃，鸭梨样品中的Vc，用高效液相色谱法进行定性和定量分析。通过对比保留时间进行定性分析，以标准曲线法进行定量分析。配制系Vc列标准溶液，以峰面积对浓度作图绘制标准曲线，再测定样品的峰面积，然后代入标准曲线方程，便可得出样品Vc浓度，进一步可算出Vc含量。实验所得标准曲线方程为y =32600x-44230，相关系数为R² =0.9971。实验测得火龙果，猕猴桃，鸭梨的Vc含量分别为6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g。高效液相色谱法测定蔬果中维生素C含量，具有操作简单、分析速度快、灵敏度高、准确性高，试剂用量少等优点。
分析测定维生素C的方法有：2,6-二氯靛酚滴定法[2]，因滴定终点较难掌握，容易影响测定结果的准确性；荧光光度法[3]，具有高灵敏度、精确度高、受干扰少特点；近红外光谱法[4]，简单高效，无需前处理且不消耗样品，但灵敏度，准确性较差；在近几年的Vc研究中使用较多的方法是高效液相色谱法[5]。方法专属性强、分离效果好、分析速度快、灵敏度高、简便易行、结果准确可靠，更适于维生素C的测定。
参考文献
[1]张畅.富含维生素C的蔬果,《东方药膳》, 2015(3):5-5
[2]杨晶晶，刘英，曲媛，崔秀明，黄璐琦.不同方法测定三七花、茎叶中维生素C含量.《食品工业科技》, 2014, 35(24):53-56
[3]冯爱玲.用荧光光度法测定果蔬品中的VC含量.《山东化工》, 2015, 44(18):64-65
图2火龙果样品的HPLC谱图
图3猕猴桃的HPLC谱图
图4鸭梨的HPLC谱图
3.3样品相关数据及Vc含量的计算
实验测得的样品相关数据如表2所示。
表2样品的液相色谱数据与样品质量
样品名称
保留时间/min
峰面积
质量/g
火龙果
2.931
57115
5.0177
猕猴桃
2.964
462889
2.2实验步骤
2.2.1仪器准备
按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。
2.2.2样品准备
准确称取切碎的蔬果样品5.0g，以1mol/L乙酸50 mL为萃取溶剂，微波功率设为自动，萃取时间为10 min，萃取温度设定为50℃，平行萃取两次（本次实验只萃取1次）。萃取液过滤后用1mol/L乙酸溶液定容至100 mL，制成供试品溶液。
2.2.3定性分析
分别取10μL 50 mg/L的Vc标准溶液和供试品溶液，进HPLC分析。根据保留时间定性分析蔬果中的Vc。
2.2.4校准曲线绘制
分别配制5，20，50，80，100 mg/L的Vc样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定3次。以Vc色谱峰高对浓度作图，绘制校准曲线。
2.2.5定量分析
液相色谱法中常用的定性方法有用已知纯物质对照定性、用文献值进行定性分析、根据相对保留值定性、与其他方法联用定性（如与质谱联用）等方法。可根据峰面积或峰高进行定量分析，具体计算方法有归一化法、标准曲线法、内标法、标准加入法。
2、如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？
答：建立未知物的液相色谱方法应该考虑两个方面的因素，一方面是选择合适的色谱柱，色谱柱是液相色谱分析的核心组件，应根据分析对象的性质选取合适的色谱柱，如正向色谱、反向色谱和离子交换色谱等等；另一方面是流动相的选择，溶剂的极性是选择的重要依据，应该使用高纯度试剂做流动相，防止微量杂质长期积累和损坏色谱柱和使检测器噪声增加，同时应避免流动相与固定相发生作用使柱效下降或者损坏柱子，试样在流动相中应有适宜的溶解度防止沉淀在柱中积累还有流动相要满足检测器需求。
[4]刘燕德，周延睿，潘圆媛.基于最小二乘支持向量机的辣椒可溶性固形物和维生素C含量近红外光谱检测.《光学精密工程》, 2014, 22(2):281-288
[5]唐敏，赵健茗，张玉，喻菊洪，段玲利.三种水果中维生素C含量的HPLC法测定与比较.《食品与发酵科技》, 2014, 50(4):53-55
5.0002
鸭梨
2.976
13262
5.0015
将各样品的峰面积作为y代入线性方程y =32600x-44230，可求出各样品中Vc的浓度，并进一步计算该样品中Vc的含量，记于表3。
表3水果样品中Vc浓度与含量
样品名称
Vc浓度/mg·L-1
Vc含量/(mg/100g)
火龙果
3.11
6.20
猕猴桃
15.56
3、微波辅助萃取法为何能达到快速高效的萃取效果？
答：微波具有穿透到物质内部的本质，穿透的深度一般是从几毫米到几十厘米的范围，随频率不同而异。所以除了极大的物体外，微波能做到被加热的物体里外同时加热，这就大大缩短了加热时间，微波的这种加热速度快、均匀特点使得在用微波辅助提取技术时，消耗的时间和原料、试剂量都有显著的减少。
供试品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。平行测定2次，记录其Vc的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中Vc的含量，结果以mg/100g表示。
3实验结果
3.1标准曲线的绘制
表1Vc标准样品的高效液相色谱数据
CVc/mg·L-1
保留时间/min
峰面积
5
3.039
150647
20
2.910
除鸭梨外，火龙果和猕猴桃的谱图都较为理想。鸭梨的谱图有很多杂峰，而且有几个峰与Vc的峰强度相当甚至大于其强度。虽然有很多杂峰，但根据系列标准Vc溶液保留时间，我们可以从鸭梨的谱图上找到其中属于Vc的峰。但是，这些峰值都是负值，所以得出鸭梨的Vc含量十分可疑。理论上来说，就算是不含Vc的溶液（如流动相的溶液）的峰值也就为零，不会为负值。而出现负峰的原因可能有：1、检测器输出信号的极性相反；2、样品的吸收小于流动相，流动相不纯；3、样品溶剂干扰；4、示差折光检测器中样品的折射率较低；5、进样中带入气泡。
4思考和结论
4.1思考题
1、校准曲线法有何优缺点？液相色谱法中常用的定性定量方法有哪些？
答：校准曲线法优点：测定工作简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，适合大量样品的分析。
标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
31.12
鸭梨
1.76
3.52
如火龙果的峰面积为57115，代入标准曲线方程y =32600x-44230中，算得火龙果样品Vc浓度为C1= mg·L-1=3.11mg·L-1，故火龙果样品中的维生素C 。同理，猕猴桃样品Vc含量为31.12mg/100g，鸭梨样品Vc含量为3.52mg/100g（存疑）。
关键词微波辅助提取法高效液相色谱法标准曲线法维生素C含量
1引言
维生素C又称“抗坏血酸”，是人体健康所必需的13种维生素之一，能在体内各器官系统中发挥作用。它既能促进受伤血管壁的愈合，又是合成体内软骨素的重要原料，软骨素则能消除血管壁上附着的胆固醇和脂肪的积存，对血管有保护作用。它还能防治冠心病，预防消化道如食道、胃、直肠癌的发生。人体所需的维生素C，90％是从水果、蔬菜中获取的。我们日常食用的蔬菜和水果中，有许多含有丰富的维生素C[1]。
Vc标准溶液：快速准确称取0.025gVc，用1mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用1mol/L乙酸溶液定容，得到100mg/L标准溶液备用，现用现配。本次实验事先准备，不需配制。
2.1.3色谱条件
流动相：3%的乙腈-0.05mol/L KH2PO4水溶液（v/v）；流速1 mL/min；柱温30℃，紫外检测波长265 nm；进样量10μL。
4、试比较液相色谱法和气相色谱法的优缺点。
答：液相色谱法分离效率较气相色谱法低，需使用有机溶剂和价格昂贵的高压泵，价格和运行费用较高，优点是能分离和分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，其流动相可选用不同极性的液体效率高，费用低，故障率低，但只限于分析气体和沸点较低的化合物，适用面较窄，而且一般都要在较高温度下进行。
本实验采用微波辅助法，用1mol/L的乙酸萃取3组质量分别为5.3361g、5.3327g、5.3266g的火龙果，猕猴桃，鸭梨中的Vc，用高效液相色谱法进行分析测定。通过对比保留时间进行定性分析，以标准曲线法进行定量分析。由系列Vc标准溶液绘制峰面积对浓度的标准曲线，通过测定样品的峰面积，再由标准曲线得出样品Vc浓度，然后进一步计算样品Vc含量。实验测得火龙果，猕猴桃，鸭梨的Vc的含量分别为6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g。高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C含量，操作简单、分析速度快、灵敏度高、准确性高，试剂用量少等优点。
613936
50
2.918
1613201
80
2.937
2524154
100
2.946
3359268
以Vc标准系列溶液的色谱峰高对其浓度作图，经线性拟合得到如图1所示的校准曲线。
图1 Vc色谱峰高对浓度的标准曲线
由线性拟合得出色谱峰高对浓度的标准曲线方程为y =32600x-44230，相关系数为R² =0.9971。
2实验部分
2.1仪器与试剂
2.1.1仪器
高效液相色谱仪：LC-2010C（岛津香港有限公司）；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；色谱柱：依利特或PhenomenexC18柱(250 mm×4.6 mm, I.D.5μm)；平头进样器。
2.1.2试剂
乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；蔬果样品（火龙果，猕猴桃，鸭梨）。实验用水为超纯水。
4.2结论
本实验用微波辅助提取法以1mol/L乙酸萃取3组质量分别为5.0177g、5.0015g、5.0002g的不同水果样品中的Vc，用高效液相色谱法对其进行分析测定。由系列Vc标准溶液可得标准曲线方程y =32600x-44230，相关系数为R² =0.9971。将样品的Vc峰面积值代入标准曲线，可得出火龙果，猕猴桃，鸭梨Vc的浓度分别为3.11mg·L-1、15.56mg·L-1、1.76mg·L-1，含量分别为6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g。在实验过程中应该出现了问题，因为鸭梨的峰值都是负值，因鸭梨是最后一个测定的，故无法知道是仪器问题还是样品的问题。高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C含量，具有分析速度快、操作简单、灵敏度高、准确性高、试剂用量少等优点。
微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量
摘要本实验以微波辅助提取法，用1mol/L的乙酸萃取3组质量分别为5.0177g、5.0002g、5.0015g的火龙果，猕猴桃，鸭梨样品中的Vc，用高效液相色谱法进行定性和定量分析。通过对比保留时间进行定性分析，以标准曲线法进行定量分析。配制系Vc列标准溶液，以峰面积对浓度作图绘制标准曲线，再测定样品的峰面积，然后代入标准曲线方程，便可得出样品Vc浓度，进一步可算出Vc含量。实验所得标准曲线方程为y =32600x-44230，相关系数为R² =0.9971。实验测得火龙果，猕猴桃，鸭梨的Vc含量分别为6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g。高效液相色谱法测定蔬果中维生素C含量，具有操作简单、分析速度快、灵敏度高、准确性高，试剂用量少等优点。
分析测定维生素C的方法有：2,6-二氯靛酚滴定法[2]，因滴定终点较难掌握，容易影响测定结果的准确性；荧光光度法[3]，具有高灵敏度、精确度高、受干扰少特点；近红外光谱法[4]，简单高效，无需前处理且不消耗样品，但灵敏度，准确性较差；在近几年的Vc研究中使用较多的方法是高效液相色谱法[5]。方法专属性强、分离效果好、分析速度快、灵敏度高、简便易行、结果准确可靠，更适于维生素C的测定。
参考文献
[1]张畅.富含维生素C的蔬果,《东方药膳》, 2015(3):5-5
[2]杨晶晶，刘英，曲媛，崔秀明，黄璐琦.不同方法测定三七花、茎叶中维生素C含量.《食品工业科技》, 2014, 35(24):53-56
[3]冯爱玲.用荧光光度法测定果蔬品中的VC含量.《山东化工》, 2015, 44(18):64-65