GC-MSMS测定啤酒中的两种亚硝胺类化合物

GC-MSMS测定啤酒中的两种亚硝胺类化合物
作者：蒙法双
来源：《现代食品》 2018年第10期
蒙法双
（北海市食品药品检验所，广西北海536000）
摘要：建立气相色谱 - 质谱（GC-MS/MS）快速测定 N- 二甲基亚硝胺（NDMA）和 N- 亚硝基吡咯烷（NPYR）两种挥发性 N- 亚硝胺类化合物的含量的测定方法快速简捷，易于操作。

结果显示：在 1 ～50μg/L 内，线性相关系数可达 0.999 4 以上；NDMA 检出限0.02μg/L，NPYR 检出限0.14μg/L，回收率为 80% ～ 115%；灵敏度高，重现性良好，相对标准偏差≤ 8%；适用于啤酒中 N- 亚硝胺残留量的检测工作。

关键词：气相色谱 - 质谱；N- 二甲基亚硝胺；N- 亚硝基吡咯烷；N- 亚硝胺；啤酒
中图分类号：TS262.5
N- 亚硝胺是一种强致癌性食品污染物[1] ，食物、化妆品、啤酒、香烟中均含有亚硝胺类化合物。

近年来，人们在饮用水、污水处理消毒后的水体以及直接受工业源污染的水体中也发现了亚硝胺类化合物，亚硝胺类化合物及亚硝化试剂与胺类物质等前体物质均是恶性肿瘤流
行病学和病因学的重要内容[2] 。

亚硝胺类化合物因其潜在的致毒致癌性而成为当前的一大研
究热点[3] 。

本文探讨啤酒中 N- 二甲基亚硝胺和 N- 亚硝基吡咯烷快速测定的方法。

1 材料与方法
1.1 仪器
气相色谱-质谱联用仪（Agilent GC7890B/MS7000C，美国 Agilent 公司），自带 CTC 自动进样器；Panasonic MDF-U5412 医用低温箱（-40 ℃，日本松下公司）；XA205DU 精
密电子天平（梅特勒 - 托利多上海公司）；3-18K 高速台式冷冻离心机（德国 sigma 公司）；5510E-DTH 超声波清洗器（美国 BRANSONIC公司）；Si-T256 涡旋混合器（美国 Scientific Industries公司）；8200 半自动凯氏定氮蒸馏仪（丹麦 FOSS 公司）；R-215 平行蒸发旋转
蒸发仪（瑞士 Buchi 公司）。

1.2 试剂
N- 二甲基亚硝胺（NDMA，浓度100 μg/mL，Accustandard Inc.）、N- 亚硝基吡咯烷（NPYR，浓度100μg/mL，Accustandard Inc.）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical 公司）、二氯甲烷（色谱纯，FisherChemical 公司）、氯化钠（优级纯，天津光复公司）、无水硫酸钠（分析纯，广东华大公司）、纯生啤酒（市售），水为去离子水。

1.3 实验方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent122-7032DB-WAX （30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

柱温升温程序：起始温度40 ℃，保持 1 min；以10 ℃/min升温至110 ℃，再以15 ℃/min升温至200 ℃，再以
40 ℃ /min 升温至250 ℃，保持 3.75 min；进样口温度：250 ℃，隔垫吹扫流量：3 mL/min，进样模式：不分流进样，进样量：1.0 μL；载气：He（纯度＞99.999%），进样流速 1.2
mL/min。

质谱条件：离子源温度230 ℃；连接管线温度250 ℃；电离方式为 EI 正离子模式；电子能量为70 eV；电子倍增器电压为2 000 V；选择离子扫描（MRM）条件：m/z：
74.0 → 44.1，42.1（NDMA）；100.0 → 55.1，70.0（NPYR）；溶剂延迟 5 min（见表 1）。

1.3.2 标准溶液的配制
标准使用液：分别吸取 N- 二甲基亚硝胺、N- 亚硝基吡咯烷标准溶液 0.5 mL，并置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀（此溶液为 5 μg/mL）。

混合标准溶液：分别吸取 N- 二甲基亚硝胺标准使用液、N- 亚硝基吡咯烷标准使用液各
1.0 mL，并置于50 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀（此溶液为100 μg/L）。

标准工作溶液曲线的制备：分别吸取0.1、 0.5、 1.0、2.0 mL 和 5.0 mL 混合标准溶液，并置于 10 mL 容量瓶中，配制成浓度为 1.0、5.0、10、20 μg/L 和50 μg/L 的溶液，供气相色谱 - 质谱仪测定。

1.3.3 样品的制备与处理
称取均质（尽量将样品冷藏后均质）试样 10 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，
加入10 mL乙腈，涡旋，在冰箱中冷冻 30 min，加入 2 个陶瓷均质子和 BondElut QuEChERS 萃取盐，迅速振荡 30 s，10 000 r/min 在0 ℃低温离心 10 min。

取上清液 6 mL 加入到 15 mLBond Elut QuEChERS 基质分散净化管中，涡旋 1 min，10 000 r/min 在0 ℃ 低温离心10 min，取上清液过0.2 μm 滤膜，GC-MS/MS 检测。

1.3.4 空白试验
除不加试样外，其他操作与 1.3.3 同样处理。

2 结果与分析
2.1 样品制备的选择
2.1.1 样品提取方法的优化
本实验参考不同的文献[4-12] ，分别以水蒸气蒸馏法[7] 、超声震荡提取法 [5]和冷冻萃取盐提取法对样品进行前处理，比较 3 种处理下的结果，表明冷冻萃取盐法比前两法提取更完全，回收率更高，操作便捷，因此选择了冷冻萃取盐法提取样品中的 N- 亚硝胺类物质。

2.1.2 水蒸气蒸馏法的优化
本实验还考察了定氮仪水蒸气蒸馏法样品和试剂 4 倍、10 倍减量来提取操作，根据方法
的检出限0.3 μg/kg 的量来加入，结果无法检出峰或被样品干扰；样品回收率也均达不到冷
冻萃取盐提取方法的效果。

2.2 柱温升温速率的优化
亚硝胺的分子质量小，沸点低，出峰快，溶剂峰容易干扰，为达到最佳分离效果，需要优
化柱温升温速率。

选择柱温起始温度为40 ℃，分别比较升温速率为 5 ℃ /min、10 ℃ /min 和15 ℃ /min 的分离效果，实验结果显示：当升温速率为5℃ /min 时，溶剂峰与 N- 二甲
基亚硝胺的色谱峰均无法明确分出；当升温速率为10 ℃ /min 时，能够有效分离，而继续升
温速率为15 ℃ /min 时，样品杂质峰与 N- 二甲基亚硝胺色谱峰的分离效果没有明显改善，
因此选择升温速率为10 ℃ /min。

当柱温升高到110 ℃时，N- 二甲基亚硝胺的色谱峰已出峰；在第二梯度将升温速率提高为15 ℃ /min 时，才能有效的分离溶剂峰与 N- 亚硝基吡咯烷。

因此，最终选择柱温为起始温度40 ℃，保持1 min，以10 ℃ /min 升温至110 ℃后，以
15 ℃ /min升温至200 ℃，再以40 ℃ /min 升温至250 ℃，保持3.75 min。

按照上述优化条件，选择电子轰击电离源（EI），正离子模式，电子能量为 70 eV，采集模式为MRM，对两
种 N- 亚硝胺混合标样分析，得到标准品的气相色谱 - 质谱总离子流图如图 1 所示。

2.3 方法的线性、检出限、回收率和精密度
2.3.1 方法的线性、检出限
精密吸取混合标准溶液 0.1、0.5、1.0、2.0 mL 和5.0 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，
用乙腈稀释并定容，摇匀，配制成浓度为 1.0、5.0、10、20 μg/L 和50 μg/L的溶液，涡
旋混匀 30 s，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，取滤液按 1.3.1 中所述的色谱条件进行测定，并
记录峰面积。

利用定量离子峰面积绘制标准曲线。

每个质量浓度的样品测定 3 次，以目标物的峰面积 Y 对其质量浓度 X 进行回归分析，得到各 N- 亚硝胺的线性方程、相关系数和线性范围，见表 2。

2.3.2 回收率和精密度
将低、中、高不同质量浓度水平的 N- 亚硝胺标准溶液加入到啤酒阴性样品中，再按照1.3.3 处理和 1.3.1所述条件进行上机检测，每个样品平行测定 6 次，精密度和回收率结果见表 3。

由表 3 可知，本方法的相对标准偏差（RSD) 小于 8%，回收率为 80% ～ 109%，表明本方法精密度和准确度均较高。

2.4 样品测定分析
取 5 批市售啤酒 6 批按 1.3 项实验方法分别测定N- 二甲基亚硝胺、N- 亚硝基吡咯烷的含量，每个样品测定 3 次，取平均值，结果见表 4。

3 结论
本实验建立的气相色谱 - 质谱联用法快速测定啤酒中两种挥发性 N- 亚硝胺含量的分析方法，通过比较不同提取方法，优化了实验分析条件。

GB 5009.26-2016 前处理简便快捷，灵敏度高，重现性良好。

适用于高通量分析检测 N- 亚硝胺类化合物，是一种易于操作，灵敏度高
的测定方法。

但目前 GB 2762-2017 中只有肉与肉制品和水产与水产制品的 N- 二甲基亚硝胺限量指标，并没有啤酒的限量指标，更没有 N- 亚硝基吡咯烷的任何限量指标。