环境消毒监测与验证

常见的化学消毒剂：
1）醇类：使蛋白质变性。如75%酒精用于皮肤和容器 表面消毒；10%丙二醇用于熏蒸消毒。
（2）酚类：损害细菌的细胞壁和细胞质膜。如苯酚 一般使用浓度为0.5-3%，甲苯酚为2-5%。
（3）醛类：如37-40%甲醛液8-9ml/立方米，加4-5g高 锰酸钾用于熏蒸，并密闭12-24小时；2%戊二醛用于 熏蒸消毒。
第二部分：洁净室环境监测
微生物总数
细菌数：在细菌培养基上菌落形成单位的平 均数。
真菌数：在真菌培养基上菌落形成单位的平 均数。
微生物总数 = 细菌数 + 真菌数
细菌、真菌培养基：
GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010
采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的 培养皿经采样后，在30 ℃ ～35℃ 培养箱中 培养，时间不少于2d；
无菌平板培养基 （预灌装无菌培养基）
无菌平板培养基优点：
1、A级、B级、C级洁净区直接使用 2、室温储存 3、有效期长 4、无菌包装、包装完整 5、特制平板 6、培养基灌装量大
55mm接触平板（Rodac Plate）
Replicate Organism Detection and Counting
API
消毒剂/杀孢子剂
常见的化学消毒剂： 1、酚类 2、醛类 3、过氧化氢类 4、季胺盐类化合物 5、以上混合物
2、忽视培养基的选择
（1）选择性低下，营养全面 （2）含有中和剂 （3）“无菌”平板培养基
培养基的选择
营养琼脂 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）
中和剂的使用：
参见：“中国药典”2010年版 附录109页 附录XI J 表1： “常见干扰物中和剂或灭活方法”
3.1.5.2 适用范围：可用于对湿、热敏感、易腐蚀的 医疗用品的灭菌。
3.1.5.4 注意事项 (5) 甲醛有致癌作用，不宜用于室内空气消毒。
臭氧灭菌
杀菌彻底，广谱 可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，并 可 破坏肉毒杆菌毒素。对霉菌也有极强的杀灭作 用。
无残留，是一种无污染的消毒剂。 臭氧是气体灭菌，能迅速弥漫到整个灭菌空间，
包括：头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛、头孢呋辛、 头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松等。
抵抗消毒剂的中和剂：
1、吐温-80 能够消除六氯酚和含汞类消毒剂的影响。
2、卵磷脂 能够消除洗必泰类消毒剂的影响。
3、卵磷脂、吐温-80 能够消除季胺类化合物（苯扎溴铵、苯扎
氯铵等）消毒剂的影响。
理想的环境测试培养基：
培养温度/时间： 1、细菌： 30～35℃ 5天。 2、细菌： 30～35℃ 2天； 霉菌或酵母菌： 20～25℃ 3天。
酵母菌和霉菌总数（TYMC）：
定义：在SDA（沙氏葡萄糖琼脂）培养基上 生长的包括细菌的菌落形成单位总的 数量。
培养温度/时间： 20～25℃ 5天。
计数原则：
1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被 作为TAMC计数的一部分。
MTDD X 最小生产批量 X 1000 单个制剂质量X每日最多使用制剂数X设备内表面积
（3）残留溶剂限度标准：
可用于清洗的化学溶剂 (三级溶剂) 在下 批生产中允许的溶剂残留小于初始溶液 浓度的0.5%。
特殊产品的限度：
特殊产品，如致敏性产品（青霉素、头孢 类）或高活性产品在使用最好的检测手段 的前提下，不应被检出。
一、FDA对设备清洁“警告信”汇总
二、清洁验证的关注点 1、残留物如何确定？ 2、残留物限度规格制定？ 3、分析方法如何验证？ 4、日常监控如何实施？
FDA关于设备洁净“警告信”统计：
1、没有定期对设备和器具进行清洁与维护， 有可能造成污染，并对药品的安全性、鉴 别特性、浓度/效价、质量和纯度造成影 响。
灭菌无死角。
卫生部：消毒技术规范 2002
空气消毒：用于无人的情况下，室 内空气 的消毒。
卫生部：消毒技术规范 2002
臭氧熏蒸：
3.1.7.4 注意事项 (1) 臭氧对人有毒，国家规定大气中允许浓度为 0.2mg/m3。 (2) 臭氧为强氧化剂，对多种物品有损坏，浓度 越高对物品损害越重，可使铜片出现绿色锈 斑、橡胶老化，变色，弹性降低，以致变脆、 断裂，使织物漂白褪色等。 使用时应注意。 (3) 多种因素可影响臭氧的杀菌作用，包括温度、 相对湿度、有机物、pH、水的浑浊度、水的 色度等。使用时应加以控制。
附录XIX Q “药品微生物实验室规范指导原则”
用于环境监测的培养基须特别防护，最好要 双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的 培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防 止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的 结果。
GB/T 16293-2010 / GB/T 16293-2010
附录B: B.3 培养基平皿培养及保存
1、残留物如何确定？
2、残留物限度规格制定？ 3、分析方法如何验证？ 4、日常监控如何实施？
残留物分类：
活性成分残留 辅料残留物（非水溶性） 清洁剂和溶剂残留 生物细胞及代谢物残留 微生物 润滑油
制剂残留关注点：
二、清洁验证的关注点
1、残留物如何确定？
2、残留物限度规格制定？
制备好的培养基平皿宜在2～8℃保存，一般以一 周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜的方法 在平皿上做好培养基的名称、制备日期的标记。
环境测试培养基：
1、TSA 用于细菌取样。 培养温度/时间：30～35℃ 不少于2天。
2、 SDA 用于霉菌和酵母菌取样。 培养温度/时间：20～25℃ 不少于5天。
洁净环境微生物检测：方法确认
目前各类官方的指导原则中，很少有对洁净环境微 生物监测方法提出要求的。
目前各类官方的指导原则中，各种微生物只有生长 在如下两种固体表面上的测试方法：琼脂培养基和 滤膜，才能够得到确认。
培养基 = 分析仪器”
培养基就是微生物检验员的“分析仪器”。 培养基的质量控制相当于“培养基验证”。
采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采 样后，在20 ℃ ～25℃ 培养箱中培养，时间 不少于5d。
！ 微生物计数的困惑
细菌培养基上生长的真菌如何计数？ 真菌培养基上生长的细菌如何计数？
总好氧微生物数（TAMC）：
定义：在TSA（大豆酪蛋白琼脂）培养基上 生长的包括真菌的菌落形成单位总的 数量。
（4）酸类：如10%的乳酸用于熏蒸消毒。
（5）氧化剂：作用于细菌酶系统。如0.2-0.5%过氧 乙酸、高锰酸钾、过氧化氢和臭氧等。
（6）表面活性剂：作用于细菌质膜，主要用于表面 消毒、浸润消毒和手消毒等。如0.1-0.2%新洁尔灭、 0.05-0.1%杜灭芬、0.1-0.2%洗必泰。
介绍一种消毒剂和消毒方式
部溶解到下批产品中的浓度限度 ≤ 10 X 10-6 检测：最终冲洗水中残留物的浓度限度 ≤ 10 X 10-6
（2）生物活性度（安全系数）：
* 正常治疗剂量的1/1000 * 含义：最低日治疗剂量（MTDD）的1/1000 * 检测：
MTDD = 每次给药数X活性成分含量X每日最少给药次数
允许残留物总量（μg/ cm2 ） =
酶（1）：青霉素酶
青霉素酶（ β-内酰胺酶）
可以有效的水解β-内酰胺类抗生素。 包括：
- 青霉素G - 氨基青霉素类，如氨苄西林、阿莫西林、匹氨西等 - 羧基青霉素类，如羧苄西林、替卡西林等 - 脲基青霉素类，如呋苄西林、美洛西林等 - 头孢Ⅰ、Ⅱ
酶（2）：头孢菌素酶
头孢菌素酶
可以有效水解头孢类抗生素Ⅲ及以上的头孢类 抗生素。
3、分析方法如何验证？ 4、日常监控如何实施？
限度和可接受标准制定原则：
1、实际的 2、可以被验证的 3、可实现的 4、能够经得起科学推敲的
PDA技术报告：1998增刊52卷 第6号
限度规格制定的三个层面：
1、目检（肉眼检测） 2、化学检验 3、微生物检验
1、肉眼检测限度：
原则：目检不得有可见残留。 * 是直观、定性、简单评估清洁的方式 * 经验数据：目见能发现最低的残留物
环境消毒、监测与验证 耳轮
本章内容：
第一部分：洁净区清洁与消毒 第二部分：洁净室环境监测 第三部分：设备清洁
心得：
我们已经走得太远，以至于忘记了为什么而出发。
黎巴嫩 纪伯伦（1883～1931）
第一部分：洁净区清洁与消毒
房间消毒的方法
表面擦拭 手工喷雾 蒸汽熏蒸（热过程） 干雾消毒、灭菌（冷处理）
2、TYMC时，如果细菌被发现生长，应该被 作为TYMC计数的一部分。
3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受 标准，应当使用含有抗生素的SDA培养基。
洁净室环境监测培养基的选择？
（关键区域使用培养基的特殊要求）
洁净区微生物监测的动态标准 （GMP2011版）
CHP2010
《中国药典》2010年版 二部
关键区域环境监测培养基：
TSA TSA+吐温80+卵磷脂 TSA+酶
第三部分：设备清洁
GMP 2011年版：
第一百四十三条 清洁方法应当经过验证，证实其清洁的效果，以 有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考 虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取 样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的 性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。
环境测试培养基：
3、用户认可并验证了的培养基。 以上摘自：GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010
环境监测中常忽视的两个方面：
1、忽视洁净环境中的影响因素 2、忽视培养基的选择
1、忽视洁净环境中的影响因素
（1）API 的残留 （2）消毒剂/杀孢子剂的残留
抗菌素 药物活性成分
FDA关于设备洁净“警告信”统计：
2、生产中所用的设备（包括器具）的清洁维 护没有建立完善的规程。
FDA关于设备洁净“警告信”统计：
3、没有保存药品生产中所用设备的维护、清 洁、消毒和检查记录，无设备清洁、维护 使用的记录，包括日期及使用时间。
写好要做的 做好所写的 记好所做的
二、清洁验证的关注点
熏蒸有助于降低洁净区内死角的微生物污染。
甲醛熏蒸：
消毒灭菌时间： 12小时接触时间（通常推荐）。
排气、通风时间： 24小时。一个漫长过程。
卫生部：消毒技术规范 2002
甲醛熏蒸：
3.1.5.1 概述： 甲醛是一种灭菌剂，对所有的微生 物都有杀灭作用，包括细菌繁殖体、芽孢、真菌 和病毒。
限度是1～4μg/ cm2
* 这是换品种生产时设备清洁的最低标准！
该种方法不适用于高效、低剂量的产品。
2、化学检验—残留物限度的确定
1) 残留物浓度限度：10 X 10-6 (百万分之十) 2) 生物活性度：正常治疗剂量的1/1000 3) 残留溶剂限度标准
（1）残留物浓度限度
10 X 10-6/百万分之十/10ppm 含义：上批产品残留在设备里的物质全
GMP2011和 EU GMP: - 平板尺寸：15 X 55 mm
- 取样单位面积：25cm2
USP〈1116〉
洁净室和其它控制环境的微生物评估
接触板的取样面积： 24～30cm2
ISO 14698 洁净室及其相关控制环境
取样面积：不小于20cm2 。 取样方法：
采样时培养基表面应与采样点接触不少于 10s，向整个接触表面施加恒定均匀的压力 （如施加的质量约为25g/cm2），不得有环形 或线性运动，装置有接触并拿开后，要加盖 并尽快用适当的培养条件培养。
消毒剂：过氧化氢和过氧乙酸 消毒方式：干雾消毒系统
干雾：
小液滴会反弹不会破碎。 大液滴破碎而湿滑表面。
干雾系统
生产7.5μ m的液滴 像气体性质
反弹离开表面 不湿润接触的表面
空间分布均匀，符合布朗运动原理。
洁净区洁净度平衡的维持
洁净区生物负荷研究（风险分析） 洁净区操作人员行为的规范 规范洁净区操作人员的行为是维持洁净区平 衡不可或缺的！
熏蒸
一种效果非常好的洁净房间的消毒方式。 在越来越“以人为本”和“环境保护”的今天，应
该格外关注“甲醛”和“臭氧”等气体消毒剂的不 良影响。
熏蒸消毒：
熏蒸（fumigating）灭菌概念： 这一标准于1980起收录于USP ，如今已为世 界各国普遍接受和采用。 在一定温度和压力的密闭条件下，化学毒剂 由固态或液态迅速转成气态渗透到生物体内， 使生物致死。