宝石鲈嗜水气单胞菌的鉴定及药敏特性

宝石鲈嗜水气单胞菌的鉴定及药敏特性
陈言峰;冯伟强;陈建酬;张继平;邹记兴;张辉华
【摘要】Two pathogenic bacteria (SS1495 ,and SS1496) were isolated from diseased Scortum barcoo in an aquafarm which was located in Sanshui district of Foshan city , Guangdong province . They were identified by microbial biochemical identification tubes and 16S rDNA sequence analysis ,and the artificial infection experiment and antibiotic susceptibility analysis were performed .The results showed that these two bacteria were facultative anaerobes which were gram negative ,rod in shape ,and
motile .They had positive indole ,methyl red and V‐P characteristics ,and utilized glucose ,maltose and mannitol .According to“Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology”,the isolates were identified to be Aeromonas hydrophilia based on the morphology ,physiological and biochemical characteristics of the bacteria .The 16S rDNA sequences of the isolates showed a high similarity to that of A .hydrophilia via BLAST network services in NCBI .The median lethal doses for the isolates to healthy S .barcoo were 7 .8 × 104 cfu/g and 3 .9 × 104
cfu/g ,respectively ,indicating they had strong pathogenicity to
S .barcoo .The isolates were highly susceptible to cefotaxime ,ciprofloxacin , norfloxacin ,and levofloxacin ,intermediately susceptible to
phytomycin ,cephazoline and neomycin ,and resistant to
tetracycline ,rifampicin and lincomycin .%从广东省佛山市三水区某养殖场患病濒死的宝石鲈体内分离到两株致病菌（SS1495， SS1496），通过细菌微量生化
鉴定管与16S rDNA序列分析对该致病菌进行了鉴定，并进行了人工感染试验和
药敏特性分析。

结果显示，该菌兼性厌氧，为革兰氏阴性短杆菌，有动力，能利用葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，靛基质、甲基红、V‐P试验均为阳性；经菌落形态观察、生理生化特性测定，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定为嗜水气单胞菌，通过PCR扩增该菌16S rDNA序列，经测序及BLAST 比对，结果与嗜水气单胞菌的同源性最高；此两株菌对宝石鲈具有很强的毒力，半致死剂量分别为7．8×104 cf u ／g和3．9×104 cf u／g ；该致病菌对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星等抗生素高度敏感，对链霉素、头孢唑林、新霉素中度敏感，对四环素、利福平与林可霉素耐药。

【期刊名称】《水产科学》
【年(卷),期】2015(000)007
【总页数】5页(P428-432)
【关键词】宝石鲈;嗜水气单胞菌;鉴定;药敏特性
【作者】陈言峰;冯伟强;陈建酬;张继平;邹记兴;张辉华
【作者单位】佛山科学技术学院生命科学学院，广东佛山 528231;佛山科学技术
学院生命科学学院，广东佛山 528231;佛山科学技术学院生命科学学院，广东佛
山 528231;佛山科学技术学院生命科学学院，广东佛山 528231;华南农业大学动
物科学学院，广东广州 510642;佛山科学技术学院生命科学学院，广东佛山528231
【正文语种】中文
【中图分类】S941.42
宝石鲈(Scortum barcoo)，属鲈形目、鯻科、革鯻属，是近年来我国从澳大利亚
引进的新品种。

该品种具有生长快、食性杂、抗病能力强等优点，且肉质细嫩，肌肉蛋白质含量高，骨刺少，具有较高的营养价值，是一种具有良好发展前景的淡水经济鱼类[1]。

然而，随着其养殖规模的迅速扩大，宝石鲈的病害接踵而至。

迄今
为止，国内已有迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)及海豚链球菌(S. iniae)[2-4]引发的宝石鲈病害的报道，而国外尚无相关报道。

笔者于2014年9月从广东省佛山市三水区某养殖场得到部分患病的宝石鲈，并对致病菌进行了分离鉴定及抗生素敏感性分析，对宝石鲈病害的防治具有重要意义。

病鱼为采自佛山市三水区某养殖场所养殖的宝石鲈。

病鱼体表有部分溃疡，腹部膨胀，肛门红肿，解剖发现肝脏呈土黄色，脾、肾及肠道出现不同程度的糜烂，并伴有血红色的腹水。

营养琼脂购自青岛海博生物技术有限公司，LB肉汤、细菌微量生化鉴定管和革兰
氏染色液购自广东环凯微生物有限公司，抗生素药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA聚合酶、PCR缓冲液(含Mg2+)
和dNTP等购自广州鸿真生物科技有限公司。

细菌16S rRNA基因通用引物由上
海英潍捷基生物技术有限公司合成。

无菌条件下从濒死的宝石鲈的肝脏、肾脏及体表病灶等处取样，接种于营养琼脂培养基，37 ℃培养48 h。

挑选优势菌落进行纯化培养，并接种于斜面培养基，37 ℃培养24 h后置于4 ℃冰箱保存备用。

用琼脂平板培养基培养致病菌，观察其形态特征、菌落大小。

并对已纯化的细菌进行革兰氏染色，显微镜下观察。

根据细菌微量生化鉴定管的说明书检测该致病菌的生理生化指标。

将分离纯化后的两株优势菌株的新鲜培养物分别配制成密度为1.24×109 cfu/mL、
1.24×108 cfu/mL、1.24×107 cfu/mL、1.24×106 cfu/mL、1.24×105 cfu/mL 和1.24×104 cfu/mL的菌悬液，然后按0.5 mL/尾的剂量，每种密度的菌悬液对应60尾健康宝石鲈(254±22) g进行腹腔注射，作为感染组；另选10尾宝石鲈，以0.5 mL/尾的剂量注射生理盐水，作为对照组。

每日正常喂养，通气换水，观察记录发病症状及死亡情况。

并从出现自然病状的人工感染鱼体内分离培养致病菌，进行再鉴定。

根据改进的寇氏法[5]计算半致死剂量。

按试剂盒的说明书分别抽提SS1495和SS1496的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。

选用细菌16S rDNA通用引物(正向:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3′)[6]进行扩增。

PCR反应体系(50 μL)为：模板DNA 2 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，4×dNTP (10 mmol/L) 2 μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+) 5 μL，DNA聚合酶(1 U/μL) 2 μL，ddH2O 37 μL。

PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min 1次；94 ℃,30 s，58 ℃,45 s，
72 ℃,90 s，共30个循环。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，送上海英潍捷基生物技术有限公司纯化后测序。

将所得到的16S rDNA序列运用NCBI的BALST程序进行同源序列比对，选取相似性较高的序列，采用MEGA 4.1软件构建系统发育树。

用无菌棉签将分离纯化的两株优势菌株的新鲜菌液均匀涂布于营养琼脂表面，无菌操作将每种药敏纸片轻轻贴在上面，37 ℃培养48 h，测量抑菌圈直径。

根据美国临床实验室标准化研究所抗菌药物敏感性试验执行标准[7]，判断该致病菌对药物的敏感程度。

分离得到的两株优势菌株编号为：SS1495和SS1496，两株菌均为革兰氏阴性短杆菌，接种在营养琼脂上，37 ℃培养24 h后，形成光滑湿润、圆形、略隆起、
边缘整齐、半透明、乳白色的菌落，直径1.2～2.0 mm。

SS1495和SS1496的生理生化特性与嗜水气单胞菌相似(表1)。

根据《伯杰氏细
菌鉴定手册》[8]，初步鉴定该两株菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。

注射致病菌后，多数试验鱼能复制出与自然发病相似的症状，从人工感染濒死鱼的肝、腹水等处均能分离到原注射细菌。

对照组的鱼摄食正常，外观没有任何变化。

计算得到菌株SS1495和SS1496对宝石鲈的半致死剂量分别为7.8×104 cfu/g
和3.9×104 cfu/g (表2)。

将测序得到的SS1495和SS1496的16S rDNA序列 (Accession No. KP168438和KP168439)分别与美国国家生物技术信息中心中的序列进行BLAST分析，显示与嗜水气单胞菌的同源性均为100%，从而鉴定此两株菌为嗜水气单胞菌。

SS1495和SS1496的16S rDNA序列与嗜水气单胞菌的16S rDNA序列自然聚
为一枝(图1)。

SS1495和SS1496对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星等抗生素高度敏感，对链霉素、头孢唑林、新霉素中度敏感，对四环素、利福平与林可霉素耐药(表3)。

嗜水气单胞菌是一种人畜鱼共患病的病原菌，是淡水鱼类的重要致病菌，也是严重危害我国淡水养殖业的主要病原之一。

通常嗜水气单胞菌被认为是一种条件病原菌，其主要致病因子有外毒素、胞外蛋白酶及S层蛋白等。

嗜水气单胞菌致病的范围
非常广泛，目前已引起了多种水产养殖动物，如淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)[9]、锦鲤(Cyprinus carpio)[10]、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)[11]、大口黑鲈(Micropterus salmoides)[12]、团头鲂(Megalobrama amblycephala)[13]、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)[14]、南方鲇(Silurus meridionalis)[15]、革胡子鲶(Clarias gariepinus)[16]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[17]等的病害。

本研究中，从患病宝石鲈分离到嗜水气单胞菌，这在宝石鲈的细菌性疾病研究中尚属首次报道。

本次患病宝石鲈的症状与王玉娟等[16]报道的革胡子鲶嗜水气单胞菌病的症状极为相似，以肝脏呈土黄色、
肛门红肿、腹部膨胀、血红色腹水等症状为典型的病理变化。

但发病鱼体表的溃烂部位较少，也较为轻微。

另有文献报道，欧洲鳗鲡[14]、锦鲤[18]、斑鳢(Channa maculata) [19]的嗜水气单胞菌病则以大面积的体表溃烂、甚至肌肉穿孔为主要外观症状。

说明嗜水气单胞菌感染不同鱼类时，其外观症状可能会存在较大的差异；即便是同一品种鱼的嗜水气单胞菌病，其症状也并不单一[20-21]，可能是由于养
殖环境、个体大小、感染条件等不同所致。

因此，鱼类嗜水气单胞菌病的诊断不应仅通过外观症状，而要结合其他方法进行诊断，避免误诊和错失最佳治疗时机。

本研究中，分别用SS1495和SS1496注射感染健康宝石鲈后，从死亡的鱼体内又一次分离到原注射细菌，证实此两株菌即为本次导致宝石鲈患病的致病菌。

SS1495和SS1496对宝石鲈半致死剂量分别为7.8×104 cfu/g和3.9×104 cfu/g，显示此两株菌对宝石鲈均具有很强的致病力[22]。

蔗糖和水杨苷均为阳性是检测致病性嗜水气单胞菌时的两项关键的生化指标[23]。

虽然SS1496的蔗糖为阴性，且SS1495和SS1496的水杨苷也为阴性，与嗜水气单胞菌不符，但结合分离菌的生化特征与16S rDNA序列的分析结果，仍可判定
该两株菌为嗜水气单胞菌。

刘春等[24]从患烂身病的大口黑鲈分离到了蔗糖为阴性的致病性嗜水气单胞菌菌株，樊星等[25]从患病罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)分离到了水杨苷为阴性的致病性嗜水气单胞菌菌株。

因此，鉴定致病性嗜水气单胞菌时，应将其生化特征与其他鉴定方法得出的结果结合起来加以确定，以免作出错误的判断。

抗生素在防治水产动物细菌性疾病时具有快捷、高效的作用。

然而，目前环丙沙星已被列为禁用渔药，因此本次宝石鲈的嗜水气单胞菌病可通过头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星进行防治。

尽管本研究中的药敏试验结果可为嗜水气单胞菌病的防治提供参考，但此结果与革胡子鲶源嗜水气单胞菌菌株[16]、罗氏沼虾源嗜水气单胞菌菌株[25]及克氏原螯虾(Procambarus clarkii)源嗜水气单胞菌菌株[26]在对四环素的
敏感性方面有较大的差异，这可能与养殖者的投药习惯比如长期使用某些药物引发了致病菌的耐药性有关，也可能与菌株来源于不同养殖动物有关。

因此，由嗜水气单胞菌引起的鱼类病害的防治过程中，抗生素选用时要以不同菌株的药敏试验结果为参考依据，避免药物的滥用。

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