1-文献阅读笔记-Cancer-Secreted mi R-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis

研究生文献阅读笔记
转移性乳腺癌分泌的外泌体RNA调节内皮细胞的迁移
作者选择了MDA-MB-231转移性乳腺癌（MBC）细胞系和MCF-10A非癌性乳腺上皮细胞系作为研究肿瘤分泌的外泌体和mi RNA的模型。

1. 通过超速离心从条件培养基中纯化的外泌体通过电子显微镜显示出典型
的杯状形态，大小范围为30至100 nm。

2. 用荧光染料（1,10-二十八烷基-3,3,30,30-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐
DiI）标记的外泌体与原代人微血管内皮细胞（HMVEC）
3. 在一系列外泌体处理HMVECs的细胞分析中，作者发现分泌MDA-MB-
231的外泌体显著刺激内皮细胞的穿孔迁移，而分泌MCF-10A的外泌体则没有。

（图D）
4. 从MDA-MB-231外泌体中提取的总RNA或小RNA，而不从MCF-10A
外泌体中提取的总RNA或小RNA的转染，概括了迁移诱导作用(图E) 从而表明了：MDA-MB-231外泌体独特的小RNA含量在内皮细胞中起迁移调节作用。

miR-105由MBC细胞特异性表达和分泌，并可通过外泌体分泌转移到内皮细胞中
1. 作者通过Solexa（Illumina）深度测序选择并分析了外泌体中的所有小RNA。

来自MDA-MB-231和MCF-10A细胞的外泌体表现出相似的小RNA 组成，并且鉴定了两系之间差异性分泌的mi RNA列表。

2. 作者进一步关注了通过多种算法（TargetScan，miRDB和PicTar）预测的miR-105，以靶向与迁移相关的基因TJP1（紧密连接TJ蛋白1；也称为ZO-1）。

3. 在一组BC细胞系中，miR-105的表达和分泌对最初从胸腔积液分离的高度转移性细胞具有特异性。

成熟的miR-105的分泌对MDA-MB-231具有高度特异性，与MCF-10A相比，它们在这些细胞中的表达明显更高（图A和
B）。

4. 为了确认分泌MBC的miR-105可以通过外泌体转移到内皮细胞，作者测量了用衍生自MCF-10A或MDA-MB-231细胞的外泌体处理的HMVEC中的miR-105水平。

用MBC起源的外泌体处理后，接受者HMVEC中观察到成熟的miR-105的细胞水平增加，但未观察到pri-miR-105或pre-miR-105的细胞水平增加，动力学在4小时开始并在24小时达到峰值（图C和D）
5. miR-105的这种增加反映了外泌体介导的mi RNA转移，但没有诱导受体细胞中miR-105的内源性表达，因为其在外泌体处理的细胞中的水平不受RNA聚合酶II抑制剂的显着影响（图E）
肿瘤分泌的miR-105下调了内皮细胞的紧密连接，破坏了内皮细胞的屏障功能
1. 作者检测了miR-105对假定靶点ZO-1的调控，将人ZO-1的3'UTR中的四个预测的miR-105结合位点克隆到报告质粒中，并评估它们对HMVEC 中miR-105的反应能力。

当两个位点I和II都存在报告基因的下游时，观察到基因表达的大幅度降低。

2. miR-105的异位表达或用衍生自MDA-MB-231（高miR-105）但不包含MCF-10A细胞（低miR-105）的外泌体治疗的结果一致，均导致HMVEC 中m RNA和蛋白水平的ZO-1表达均显着下降（图A–C）。

3. 通过用miR-105抑制剂转染受体细胞，可以消除MDA-MB-231外泌体的作用（图B和C）。

4. 当通过免疫荧光分析HMVEC单层时，用高miR-105外泌体（由MCF-10A / miR-105和MDA-MB-231分泌）处理的单分子膜显示ZO-1显着降低和另一种TJ蛋白的内在化细胞连接，而血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）的连接水平未受到明显影响（图3D）。

5. 接下来，通过测量罗丹明标记的右旋糖酐（相对分子质量70,000）穿过生长在0.4毫米滤膜上的HMVEC单层的穿越来进行体外渗透性测定。

与血
肿瘤分泌的miR-105诱导血管通透性并促进转移
1. 为了进一步证明外泌体miR-105对内皮屏障的体内作用，我们注射了MCF-10A / vec（low-miR-105），MCF-10A / miR-105（high-miR-105）分泌的外泌体，或将MDA-MB-231细胞（high-miR-105）或PBS作为对照，注入NOD / SCID / IL2Rg无效（NSG）小鼠的尾静脉中，并检查肺和脑，以及在外泌体治疗后经常发生乳腺癌转移的器官。

结果表明，miR-105较高的外泌体，但miR-105较低的外泌体却没有显着增加肺和大脑中miR-105的水平（图A）伴随着在CD31阳性的内皮细胞中ZO-1表达的降低（图4B）和增强的血管通透性（图4C；图S3）。

2. 在另一项实验中，小鼠在心内注射荧光素酶标记的MDA-MB-231细胞之前，先用MCF-10A或MDA-MB-231细胞分泌的外泌体（或以PBS为对照）进行预处理。

三周后，使用mouse18S作为内部对照定量转移，收集组织用于荧光素酶基因的逆转录定量PCR（RT-qPCR）。

与它们破坏内皮屏障的作用一致，MDA-MB-231而不是MCF-10A外泌体显着增加了肺和脑的转移（图4D）。

miR-105在低转移的BC细胞中过表达可促进体内转移
为了确定原发肿瘤中的miR-105水平是否能调节内皮屏障和转移，作者在MCF-10A衍生的致癌系MCFDCIS中稳定表达了miR-105，与载体转导的控制细胞相比，表达miR-105的MCFDCIS细胞还分泌更高水平的miR-105，并进行了一系列的实验。

这些结果共同表明，表达并因此分泌更高水平的miR-105的肿瘤细胞通过增强肿瘤细胞侵袭和弱化宿主内皮屏障的双重优势获得更大的转移潜力。

miR-105抑制抑制转移并体内恢复血管完整性
为了进一步探讨miR-105干预的潜在治疗效果，作者从高miR-105，高转移MDA-231-HM细胞建立了异种移植物。

用抗miR-105化合物体外处理这些细胞可提高ZO-1表达并抑制迁移。

与接受PBS或对照化合物治疗的组相比，使用抗miR-105化合物进行的体内治疗减少了原发肿瘤的体积并抑制了远处
miR-105与BC中的ZO-1表达和转移进展有关
miR-105可以作为转移潜力的预后标志物。

为了探索这一点，作者首先在转移前阶段（癌细胞植入后第3周）或转移阶段（癌细胞植入后第6周）与无肿瘤动物相比，测量了携带MDA-231-HM异种移植肿瘤的小鼠的血清mi RNA水平。

在转移前期和转移期的荷瘤动物中，循环miR-105而不是其他两个mi RNA（miR-155和miR-375）显着升高（图A），2. 接下来，作者比较了38位II期和III期BC患者的血清miRNA水平。

通过比较循环外泌体中miRNA的水平和相应的耗尽外泌体的血清组分，发现外泌体中主要存在循环miR-105和miR-181a，而两个外泌体中均检测到另外两个miRNA（miR-375和miR-422b）。

3.为了进一步确定BC患者中循环miR-105在调节内皮细胞方面是否具有功能活性，用来自健康供体或具有高水平miR-105水平的BC患者的血清治疗。