优化高效液相色谱法检测万古霉素的血药浓度

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.039 •药物研究-优化高效液相色谱法检测万古霉素的血药浓度
张亮陆磊侯文洁周秋云丁红梓王洁
【摘要】目的建立人血浆中万古霉素的高效液相色谱检测方法，为临床给药方案提供参考。

方法采用6%
高氯酸沉淀血浆中的蛋白，以乙腈-0. 05 m o l/L三氟乙酸（22:3)为流动相，流速1m l/m in,检测波长280 nm。

结果
万古霉素在1.56 ~ 100 |x g/m l范围内线性关系良好，批内、批间准确度的偏差<5% ,批内、批间精密度<8%,在室温
放置8、16、24 h及-20^放置15 d后，万古霉素保持稳定，偏差小于5%。

结论本方法测定万古霉素血药浓度具有
准确和灵敏度高的特点，适合在治疗药物监测的应用中进行推广。

【关键词】万古霉素；高效液相色谱法；药物浓度检测
【中图分类号】R917.1【文献标识码】 A 【文章编号】1002 -7386(2017)18-2861 -03
万古霉素是当前治疗革兰氏阳性菌，特别是耐甲 氧西林金黄色葡萄球菌（M R S A)最有效的药物之一。

一直以来，万古霉素引起肾毒性是其在使用过程中最 大的担忧。

肾毒性是由于纯度较低导致的，随着制药 工艺的优化和纯度的提高，毒性反应的发生率显著降 低[1]。

然而，临床实际中的情况是非常复杂的，患者 往往合并有其它的基础疾病、老年患者还常常合用其 他多种治疗药物。

因此，对于万古霉素相关的肾毒性 不可掉以轻心[]。

万古霉素属于治疗窗窄的药物，据 报道，即使在治疗窗内也有相关肾毒性报道[]，若超 过了治疗窗，则风险会大大增加。

目前关于万古霉素 药物浓度监测的报道虽然有很多[45]，但在临床进行 监测要求方法简单，操作简便。

我们认为在已有的方 法上依然有着进一步优化的空间。

因此，本文参考了 H P L C法检测万古霉素血药浓度的相关报道，在此基 础上进行了方法学的改进，并成功用于临床患者。

1材料与方法
1-1仪器与试药L C-20A B高效液相色谱系统（检 测器为S P D-M20A，岛津，日本）；电子分析天平(E B224,0.1m g，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；高速离心机（T G1650-W S，上海卢湘仪）；万古霉素对 照品（中国药品生物制品检定所，批号：30360- 200301);注射用盐酸万古霉素（Eli Lilly Japan K.K，规格:0.5g，批号:M W19231);乙腈（M e m k，德国）为色 谱纯，三氟乙酸（国药集团，中国）为分析纯，实验用水
项目来源：常州四药-南京药学会医院药学研究基金（编号：2014YX013)
作者单位：210029南京市，东南大学医学院附属南京胸科医院药学部
通讯作者:王洁，210029南京市，东南大学医学院附属南京胸科 医院药学部；
E-mail :xkyywj@ 163. com 为M I L L I P O R E自制超纯水。

1.2方法
1.2.1 色谱条件色谱柱：C L C-O D S(250 m m x 4. 6 m m，5 ^1，S M I M A D Z U，日本）；流动相：乙腈 -0. 05 m〇l/L三氟乙酸（3: 2);柱温4°C;流速 1ml/m i n;检测波长280 n m;进样体积:20pl。

1.2.2血浆样品处理取血浆样品500 p l于E P管 中，加人6%高氯酸300 涡旋震荡1min，15 000 m m n
离心3 m i n后，取上清液经0. 45 p m滤膜过滤后进样 分析。

2结果
2.1专属性试验按“2.1”项下色谱条件，万古霉素 保留时间在8.6 m i n左右，峰形良好，血浆内源性物质 对分析无干扰，无杂质峰干扰检测。

见图1。

2.2标准曲线和定量下限精密秤取万古霉素对照品适量溶于10 m l容量瓶中，加水溶解成1m g/m l的标准储备液。

在空白血浆中加入适量标准储备液，使 血浆中药物浓度分别为1.56、
3. 125、6. 25、12. 5、25、50和100 pg/m l。

按“2.2”项下的方法操作，记录下色 谱图，以浓度为横坐标（X)，峰面积为纵坐标（Y)，通 过加权最小二乘法进行回归运算，得到回归方程。

试 验结果表明万古霉素血药浓度在1.56 ~ 100 pg/m l范 围内线性关系良好，定量下限（L L O Q)为1.56 pg/m l。

2.3准确度与精密度试验分别于500 p l空白血浆 中加入标准储备液，配制成含低、中、高（2、10、80 pg/m l)3中不同的万古霉素血浆样品，每种浓度平 行配制5份，再按“2.2”项下方法进行处理，依据标准 曲线计算出万古霉素的血浆浓度，考察批内准确度和 批内精确度;连续3 d重复相同的操作考察批间准确 度和批间精确度。

批内、批间准确度的偏差<5%，批 内、批间精密度< 8%。

考察指标完全符合生物样品分 析的要求。

见表1、。

表1批内准确度和精密度n=5浓度（pg/ml)实测值准确度（％)偏差（％)精密度RSD(%)
21.97±0.03497.32.31.4
1010.07±0.128100.4-0.41.6 8081.27±1.254103.4-3.62.1
表2批间准确度和精密度n=5浓度（pg/ml)实测值准确度（％)偏差（％)精密度RSD(%)
21.87±0.07294.44.94.2
109.86±0.34598.50.67.6 8078.54±1.32498.61.27.2
2.4回收率试验分别于500 p i空白血浆中加入标 准储备液，精确配制成含低、中、高（2、10、0 pg/m l)3 中不同的万古霉素血浆样品，每种浓度平行配制5份，按“2.2”项下方法处理后再进行分析，记录峰面积。

800 P流动相代替空白血浆配制相应的对照品溶液，每种浓度平行配制5份的样品，进样20 p i进行检测，每个浓度测5遍，按“2. 2”项下方法处理后再进行分 析，记录峰面积。

以每种浓度两者峰面积之比计算提 取回收率。

绝对回收率大于90%。

见表3。

表4
表3回收率试验n=5浓度（pg/ml)提取回收率（％)RSD(%)
295.5±1.62.3
1096.6土1.11.7
8095.2±0.91.4
2.5稳定性考察血浆样品分别在室温放置8、16、24 h及- 20°C放置15 d后进行分析。

在这几个考察 条件下，万古霉素的测定值均保持稳定，相对偏差小于 5%。

见表4。

稳定性试验 0= 5)条件浓度（pg/ml)平均测得浓度（pg/ml)准确度(% ）偏差(%）室温放置8h21.9997.82.3
109.8698.31.7
8078.9898.51.6室温放置16h21.9997.32.5
109.7898.11.9
8078.5497.91.9室温放置24h21.9997.22.9
109.6797.12.2
8078.3397.12.4在-20C放置15d21.9997.12.9
109.6496.42.5
8078.0496.52.6
2.临床实际应用本方法成功用于我院10例革兰3讨论
氏阳性菌感染患者的血药浓度检测，检测对象大都是 老年患者，用药为每8小时1 /或每12小时2 /。

检测 时间点为经4剂万古霉素治疗后，第5剂给药前30 m i n的浓度。

从测试结果看，患者的血浆中的药物 浓度有差异，浓度在7. 8 ~ 18. 6 p//m i，平均浓度(14. 5 ±4.3) pg/ml。

早前由于万古霉素在临床上的使用受到很大程度 的限制是由于其易引起毒性，相比较半合成青霉素更 加安全。

近些年（M R S A)感染率升高导致万古霉素的 使用增加[6]。

由于万古霉素的治疗窗窄，低浓度导致 耐药和治疗不佳，高浓度导致治疗毒性。

因此，对患者
经行治疗药物检测是非常有必要的。

美国感染病学在
2009年万古霉素治疗指南中之处，其谷浓度应维持在 10 m g/L以上，对于药敏结果提示最低抑菌浓度(M I C)达到1m g/L需要将谷浓度维持在15 ~ 20 m//L[7]。

对于峰浓度来说由于没有发现其与毒性 和疗效的之间有明确关系，所以不需要监测峰浓度。

目前主要有两种分析方法可以用来检测血浆中万 古霉素浓度，一种是免疫法（包括放射免疫分析法和 酶放大免疫检测法）；另一种是色谱法[4’5]。

免疫法的 特点是简单、快速、有商业化的试剂盒可供使用。

但是 免疫法有难以克服的缺陷，一是成本过高;二是万古霉 素相关物质（降解产物或生产过程中引入的物质）也 会与试剂发生反应从而影响结果。

大部分已报道检测 万古霉素血药浓度的方法还是色谱法[8_10]。

色谱法 具有更高的灵敏度和特异度，在检测低浓度药物时更 有优势。

由于万古霉素是水溶性抗生素，如果使用有机溶 剂萃取就会导致药物回收率的降低。

所以蛋白沉淀法 是更能够确保准确性的方法。

大部分已有的方法所使 用高氯酸的浓度都在10%以上[1，2]。

而本实验使用 的是6%高氯酸。

由于高氯酸属于有强腐蚀性的强 酸，若长期使用浓度较高的酸会对色谱柱有损伤。

我 们在使用了 6%、％、0%和15%四种高氯酸作为沉 淀剂进行试验后，发现对于10 p//m1万古霉素的回收 率并没有显示出差异。

所以最终选用了6%的高氯 酸。

也有报道使用有机溶剂（甲醇或乙腈）沉淀蛋白 的，我们经过反复试验认为使用有机溶剂会减少有效 保留时间，而且有可能将保留在色谱柱上的弱极性杂 质洗脱下来混进待测物中，对分析结果造成影响。

所 以，在准确度和精密度的前提下应该可以优先选择有 机酸溶液。

在流动相方面，几乎所有研究中水相都使用了磷 酸二氢钾缓冲盐。

使用缓冲盐体系有很多缺陷：（1) 对色谱柱损伤较大；（2)结束后需要长时间用高比例 水冲洗，否则易堵塞色谱柱；（3)配制过程较为麻烦;
(4)用高比例有机相进行分析时磷酸盐有析出的可 能。

在本试验中尝试使用0. 05%三氟乙酸溶液做为水相，由于万古霉素的P k a为2.5 ~ 4.5，在偏酸性的 流动相中待测物会以分子形式经过色谱系统，不会形 成拖尾。

经过试验比对，使用0.05%三氟乙酸溶液各 项检测指标都能达到要求。

本试验具有简单、准确、经济的特点，使用15C M 高保留C18柱即可获得很好的保留时间。

能准确测 定血浆中的万古霉素、特别适用于临床样本的检测。

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