荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介
一．实时荧光定量PCR的基本原理
理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。

如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的
在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义
Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系
Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势
由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。

因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。

二．荧光定量PCR的2类方法（按荧光产生的原理分类）染料法（SYBR Green法）
染料法即利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。

该方法与常规的PCR 类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。

该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。

与EB的性能类似，SYBR Green也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBR Green能特异性的与之结合并在497nm激发下。

染料法的优点：1，无需设计、合成探针，实验成本低；2，使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。

染料法的缺点：1，由于SYBR Green与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。

因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增；2，由于SYBR Green的上述特点，该方法不能应用于Multiplex QPCR技术。

（在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况）
探针法（以TaqMan探针为例）
探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于：在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。

目前市场上的探针主要种类有：TaqMan、Molecular Beacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最广泛。

TaqMan探针的结构：长度与普通PCR引物类似，大约20bp左右。

在5’与3’端各标记有一个荧光基团，5’的荧光基团称为报告基团（Report），3’的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。

TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特定波长的荧光信号。

TaqMan探针法工作原理：
➢变性（95°C）：模板dsDNA充分解链；
➢复性、延伸、酶切降解（60°C）：1，探针与靶序列结合；上、下游引物与靶序列结合；
3，上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5’→3’聚合功能）；4，当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥5’→3’外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；
➢荧光信号的检测：由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。

与染料法相比TaqMan探针法的优点：1，实验的特异性得到了提高；2，对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行Multiplex QPCR。

与染料法相比TaqMan探针法的缺点：1，探针的使用提高了实验成本；2，探针的使用需要设计及优化。

三．确定样品起始模板拷贝数的2类方法
绝对定量
采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数的样品）建立标准曲线，建立Ct 值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。

标准品的种类：含目的基因的质粒（经酶切线性化处理，其中的插入片段必须采用与QPCR 实验中相同的引物扩增得到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品使用较为广泛。

标准品的定量：UV A260、荧光分光光度检测等。

为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进行归一化的处理：1，对各样品进行
细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后得到的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。

相对定量
与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。

就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。

某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下：
公式说明：
Rel.Quantity：目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；
GOI：目的基因（Gene of Interest）；
Norm：内参基因（Reference Gene，Normalizer，House Keeping Gene）
Eff：PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率；使用该公式时，需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2-ΔΔCt。

➢为什么需要设立内参基因？
如果仅仅比较目的基因的ΔCt是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响：1，样品处理时不同的纯化得率；2，RT-PCR过程中不同的逆转录效率；3，QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。

由于上述3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上，因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理，使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，这样得出的结果才具有可信性与良好的重复性。

（注意：内参基因的（1+EffΔCt）位于分母的位置，进行除法的运算。

）
➢如何选择内参基因？符合什么标准的基因可以作为内参基因？
由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必须满足以下3个条件：1，在不同的细胞、组织中具有恒定的表达；2，在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；3，在不同的实验状态下具有恒定的表达。

内参基因的ΔCt一般小于2（即小于1倍的表达差异），一般采用的内参基因都是一些管家基因，使用最多的为：ß-actin、GAPDH、18sRNA等。

需要注意的是：并非传统意义上的管家基因都能作为内参基因，还是需要与具体的实验结合起来综合考虑。

例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达，不能作为内参基因。

因此在选择内参基因时建议：1，查阅相关文献；2，设立多个内参基因；3，采用表达谱的方法确定理想的内参基因。

➢采用Singleplex还是Multiplex？
可以采用Singleplex的方法在不同的反应管内得到同一样品目的基因与内参基因的Ct 值，再利用上述公式进行计算。

在这种情况下可以使用SYBR Green法进行实验。

也可采用Multiplex的方法在一个反应管内得到同一样品目的基因与内参基因的Ct值，再利用上述公式进行计算。

采用TaqMan探针法（目的基因与内参基因的探针进行不同的荧光标记）可以采用Multiplex的方法。

Multiplex对于Singleplex的优点：1，节约了样品的使用量，尤其是针对样品比较珍贵的情况；2，可以加快实验的速度，节约实验成本；3，避免了Singleplex的误差，因为目的基因与内参基因是在不同的反应管内得到的。

四．引物与探针的设计
QPCR引物设计与常规PCR引物设计的原则基本相同，需特别注意的就是为了尽可能使PCR扩增的效率达到100%，因此QPCR扩增产物的片段长度一般小于400bp，在设计引物的时候尽可能将产物长度控制的短些。

引物与探针设计的要求：1，高PCR扩增效率，接近100%；2，高特异性，扩增过程中没有非特异性产物；3，实验的重复性，相关系数接近1。

SYBR Green法（引物设计基本原则）
➢PCR扩增产物长度范围100~400bp，扩增片段中避免出现强烈的二级结构；
➢引物的GC含量为30~80%，最佳范围50~60%；
➢引物的Tm值范围为62~67°C，上、下游引物的ΔTm小于2°C；
➢引物序列中避免出现连续4个相同的碱基；
➢避免引物本身或引物间形成二级结构，在引物3’端最后5个碱基中避免出现2个以上的G或C；
➢引物最好设计在不同Exon的区域，其间含有一些比较大的Intron，避免RNA纯化过程中基因组DNA的污染；
➢利用BLAST或其他引物设计软件（如Beacon Designer）对引物的特异性进行检查。

TaqMan探针法（引物设计基本原则）
➢PCR扩增产物长度范围70~150bp，扩增片段中避免出现强烈的二级结构；
➢先确定探针的位置与序列再设计相对应的引物；
➢引物的GC含量为30~80%，最佳范围50~60%；
➢引物的Tm值范围为58~60°C，上、下游引物的ΔTm小于2°C；
➢引物序列中避免出现连续4个相同的碱基；
➢避免引物本身或引物间形成二级结构，在引物3’端最后5个碱基中避免出现2个以上的G或C；
➢引物最好设计在不同Exon的区域，其间含有一些比较大的Intron，避免RNA纯化过程中基因组DNA的污染；；
➢利用BLAST或其他引物设计软件（如Beacon Designer）对引物的特异性进行检查。

TaqMan探针法（探针设计基本原则）
➢先确定探针的位置与序列再设计相对应的引物；
➢探针的GC含量为30~80%，最佳范围40~60%；
➢探针的Tm值比上、下游引物的Tm值高10°C；
➢探针5’端的第一个碱基不能是G；
➢探针5’端第一个碱基与上游引物3’端最后一个碱基的距离控制在1~10bp范围内；
➢探针序列中避免出现连续3个以上相同的碱基，尤其是G；
➢采用分析软件（如Beacon Designer）分析，避免探针本身或探针与引物间形成强烈的二级结构。

五．QPCR实验优化的3大指标
与引物、探针设计的要求相同，QPCR实验优化的目的就是获得：1，高PCR扩增效率；2，高特异性；3，良好的实验重复性；4尽可能广的检测动力学范围。

一般在采用设计好的引物与探针进行大规模样品实验前，需要通过预实验确认PCR扩增效率、特异性、重复性并进行优化。

PCR扩增效率
无论采用绝对定量还是相对定量，PCR扩增效率越接近100%越好，因为在这种情况下实际的PCR扩增就越符合2n扩增，这样在相对定量时就能采用2-ΔΔCt的默认算法，结果更加准确。

判断PCR扩增效率的方法是采用含目的基因的质粒、PCR扩增产物、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等建立梯度（如10倍、5倍或2倍的稀释）进行类似于标准曲线的实验，实验结束后iCycler iQ数据分析软件会根据稀释度自动的计算扩增效率，公式如下：Efficiency = [10(-1/slope) ] – 1（扩增效率应在90~110%的范围内）
实验的重复性
实验的重复性采用相关系数（Correlation Coefficient，R值）进行评价，R值越接近1
说明实验的重复性越好，一般R值应大于0.99。

在上述判断PCR扩增效率的实验时，每个梯度可以设置3个复孔，实验结束后iCycler iQ 数据分析软件会自动计算出实验的相关系数。

PCR扩增的特异性
与常规PCR的要求不同（常规的PCR只要求能够扩增到靶序列即可，对产物的特异性要求并非很高），QPCR要求PCR扩增具有很好的特异性，尤其在采用SYBR Green方法时候。

如果扩增过程中存在非特异性产物，这些非特异性的产物也会消耗反应体系中的试剂，从而降低扩增效率最终导致数据的不准确。

实验完成后可以采取常规的琼脂糖电泳方法来判断扩增产物的特异性，但是该方法存在以下不足：1，容易导致扩增产物对实验室的二次污染；2，由于QPCR中目的片段的长度都比较短，因此某些情况下类似引物二聚体等非特异性扩增产物与目的片段很难区分。

iCycler iQ可以采用熔点曲线的方法更加准确的判断扩增的特异性并克服上述常规电泳方法的不足。

“熔点曲线”是基于如下的原理：不同的PCR扩增片段（dsDNA）具有不同的Tm值，因此只要检测扩增完成后产物的Tm值即可了解扩增的特异性。

可以采用SYBR Green或Molecular Beacon来实现“熔点曲线”的检测功能，下面以SYBR Green为例说明熔点曲线的工作方式：1，在扩增完成后在95°C保温1分钟，在此条件下扩增产物（包括特异与非特异的产物）都处于解链状态，SYBR Green全部游离，荧光信号强度最低；2，退火至55°C保温1分钟，在此条件下扩增产物（包括特异与非特异的产物）全部复性，SYBR Green全部结合到dsDNA上，荧光信号强度最强；3，从55°C缓慢的升温到95°C（例如每10秒种升温0.5°C）并实时收集荧光信号，在此缓慢升温的过程中达到某产物的Tm值时，荧光信号就会出现明显的衰减，按此就可以判断扩增产物中所有产物的Tm值。

良好的扩增特异性反应——原始数据（荧光信号的变化）
良好的扩增特异性反应——经处理的数据（上述原始数据经过一阶倒数的处理）
具有非特异性扩增的反应——原始数据（荧光信号的变化）
具有非特异性扩增的反应——经处理的数据（上述原始数据经过一阶倒数的处理）
六．QPCR实验优化中的注意事项
1．当采用熔点曲线方法发现存在非特异性扩增的情况时（如上面的例子中，特异性产物Tm值为99°C左右，非特异性产物的Tm值为78°C左右），提高荧光信号采集的温度（例如采集温度为82°C）是没有用的。

因为虽然没有收集非特异性产物的荧光信号，但是这些非特异的扩增还是存在的，并且降低了PCR扩增的效率。

一般存在非特异性扩增的情况下最理想的方法是重新设计引物。

2．有时候PCR的扩增效率不理想不是由于方法（如引物探针的设计、体系的优化等）本身的问题，而是由于在建立稀释梯度时操作上的误差引起的。

因为PCR的扩增效率是根据标准曲线的斜率计算的，如果稀释梯度本身建立的不准确那么最后得到的斜率、PCR扩增效率肯定是不符合要求的。

因此建议在进行QPCR实验时，无论是梯度稀释、配制反应体系还是加样采用的最小体积量最好大于5ul，并使用定期进行校正的移液器以避免操作上的误差。

3．在采用相对定量方法时一般认为不需要建立标准曲线，其实为了确保定量结果的准确性与可靠性最好在大规模进行未知样品的实验前也建立标准曲线。

因为：1，利用标准曲线可以了解引物对或引物探针对的扩增效率（见三/相对定量）；2，利用标准曲线可以了解某引物对或引物探针对的检测可信区间，因为不同的引物对或引物探针对都具有一定的动力学检测范围，在该范围内得到的数据才是稳定与可靠的。

因此利用标准曲线可以得到最优的引物对或引物探针对，大致可以覆盖所有样品表达丰度的范围。