SPE-HPLC法测定辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量

SPE-HPLC法测定辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量
陈娜娜;李彦超;宋汉敏;李振国
【摘要】目的:建立辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的SPE-HPLC限量检查法.方法:采用超声、固相萃取法对制剂中马兜铃酸Ⅰ进行提取纯化,HPLC法对其含量进行检测.色谱柱为Agilent Zorbax SB-C 18柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(60:39:1),体积流量1.0 mL/ min,检测波长390 nm.结果:马兜铃酸Ⅰ在进样量2.632 9～105.314 ng浓度范围内线性关系良好(r =0.999 9).检测限为2.6 ng,平均回收率100.7％,RSD=2.81％(n=9).结论:该法简捷,结果准确可靠,可用于辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的限量检查.
【期刊名称】《中医研究》
【年(卷),期】2014(027)001
【总页数】3页(P72-74)
【关键词】辛芩胶囊;马兜铃酸Ⅰ;固相萃取-高效液相色谱法;含量测定
【作者】陈娜娜;李彦超;宋汉敏;李振国
【作者单位】河南中医学院,河南郑州450008;河南省食品药品检验所,河南郑州450003;河南省食品药品检验所,河南郑州450003;河南省食品药品检验所,河南郑州450003
【正文语种】中文
【中图分类】R284
辛芩胶囊由细辛、黄芩、荆芥、防风、白芷、苍耳子、黄芪、白术、桂枝及石菖蒲等10味中药配伍组成，具有益气固表、祛风通窍等功效，临床用于治疗过敏性鼻炎鼻痒、喷嚏、流清涕等症。

制剂处方中的细辛含有微量的肾毒性成分马兜铃酸Ⅰ［1］，后者具有抗感染、抗癌及增强细胞免疫功能等［2－4］作用，但长期服用会使肾脏间质性纤维化而导致肾衰竭［5］。

因此，对辛芩胶囊进行马兜铃酸Ⅰ的限度测定可保证临床用药的安全。

由于马兜铃酸Ⅰ具有弱酸性，曾采用碱液提取、酸液沉淀的方法［3］，但在马兜铃酸Ⅰ出峰位置有干扰。

本文采用固相萃取法提取，结果在马兜铃酸Ⅰ出峰位置无干扰，因此选择采用SPE－HPLC法进行辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量的测定。

1 药品、试剂与仪器
马兜铃酸Ⅰ含量为98.8%，供含量测定用，由中国食品药品生物制品检定所提供，批号110746－201108;辛芩胶囊，规格0.5 g/粒，保和堂(焦作)制药有限公司产品，批号为20110601，20110602，20110603;细辛药材(批号001，002，003)，由保和堂(焦作)制药有限公司提供，经雷留成教授鉴定为马兜铃科细辛属北细辛的干燥全草。

甲醇为色谱纯，购自北京化工厂;水为超纯水。

Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司产品;XR 205SMDR分析天平，瑞士Precisa公司产品;KQ－250E型超声仪，昆明市超声仪有限公司产品;Polymer SAX Box(Agilent，60 mg/3mL)固相萃取小柱，填料为季胺键合硅胶，规格为4.6 mm×100 mm，
粒度为25～35μm，孔径为1 000Å。

2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取马兜铃酸Ⅰ对照品适量，加甲醇制成3.25 mg/L的溶液，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备
2.2.1 辛芩胶囊供试品溶液
称取辛芩胶囊约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中;精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声30 min，放冷，称定;再用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过;精密量取
续滤液5 mL，加至固相萃取小柱(依次用甲醇、水、甲醇各2 mL预洗)上，依次
用水、甲醇各3 mL洗涤，弃去洗脱液，再用体积分数8%的甲酸甲醇溶液洗脱;收集4 mL洗脱液，用洗脱液定容至5 mL量瓶中，摇匀，即得辛芩胶囊供试品溶液。

2.2.2 阴性样品溶液
按辛芩胶囊处方及工艺制备不含细辛的阴性样品，按照2.2.1项下方法操作，制得缺细辛阴性对照品溶液。

2.2.3 细辛供试品溶液
精密称取细辛5 g，按照2.2.1项下方法操作，即得细辛供试品溶液。

2.3 色谱条件
色谱柱为 Agilent Zorbax SB－C18柱(250 mm× 4.6mm，5μm)，流动相为甲
醇－水－冰醋酸(60∶39∶1)，体积流量1.0 mL/min，检测波长390 nm，柱温30℃，进样量10μL。

理论板数按马兜铃酸Ⅰ 峰计应不低于2 000。

取马兜铃酸
Ⅰ对照品溶液、辛芩胶囊供试品溶液、阴性样品溶液和细辛供试品溶液各10μL注入液相色谱仪，结果显示辛芩胶囊阴性，无干扰。

见图1。

图1 含量测定的液相色谱图
2.4 方法学考察
2.4.1 线性试验
精密称取马兜铃酸Ⅰ对照品5.36 mg，加甲醇制成质量分数为5.265 7 mg/L的对照品溶液b，精密吸取该对照品溶液0.5，1，3，5，7，10，15，20μL，注入高
效液相色谱仪，测定马兜铃酸Ⅰ的吸收度积分值。

以测得的吸收度积分值(Y)为纵
坐标，对照品进样量(X)为横坐标绘制标准曲线。

结果马兜铃酸Ⅰ的线性方程
为:Y=1.272 5 X－1.3176，r= 0.999 9。

结果表明:马兜铃酸Ⅰ在2.633～105.314 ng范围内进样量与吸收度积分值线性关系良好。

2.4.2 检测限测定
按上述色谱条件，先取甲醇进样，测出噪音，再取已知浓度的马兜铃酸Ⅰ对照品溶液进样，根据其对应的峰高值，将对照品溶液稀释至信噪比(S/N)约为3时，测得马兜铃酸Ⅰ的检测限为2.6 ng。

2.4.3 精密度试验
精密吸取对照品溶液10μL，按上述色谱条件测定，重复进样6次。

测得马兜铃酸Ⅰ吸收度积分值的RSD为1.0%(n=6)。

结果表明本法精密度良好。

2.4.4 重复性试验
取同一批号的样品，照2.2.1项下方法，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件，进样10μL测定，结果均未检出马兜铃酸Ⅰ。

2.4.5 回收率试验
称取辛芩胶囊(批号为20110601)样品9份，每份各约5 g，精密称定，分3组，每组3份，精密加入浓度为4.212 6，5.265 7，6.318 8 mg/L的马兜铃酸Ⅰ对照品甲醇溶液25 mL，按2.2.1项下操作，制备加样回收率供试品溶液。

按2.3色谱条件项下方法测定，并计算马兜铃酸Ⅰ回收率。

结果见表1。

2.4.6 稳定性试验
精密吸取2.4.5回收率试验项下3－1加样回收溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12，16，20 h进样10μL，按上述色谱条件测定，马兜铃酸Ⅰ的吸收度积分值RSD值为2.1%(n=9)。

结果表明:该提取方法稳定性较好。

2.5 样品测定
取 3批样品(批号为 20110601，20110602，20110603)，照2.2.1项下方法制备溶液，测定结果见表2。

测定结果表明:辛芩胶囊中未检测出肾毒性成分马兜铃酸Ⅰ。

表1 回收率试验结果?
表2 辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量测定结果?
取3批细辛药材(批号为001，002，003)，照2.2.3项下方法制备溶液，测定并
按干燥品计算药材中的马兜铃酸Ⅰ含量，结果见表3。

结果表明: 3批细辛药材均
符合《中国药典》2010版一部细辛项下“马兜铃酸Ⅰ不得过0.001%”的限量规定。

表3 细辛药材中马兜铃酸Ⅰ的含量测定结果批号细辛药材中马兜铃酸Ⅰ含量/% 001 0.000 3 002 0.000 4 003 0.000 7
3 讨论
3.1 测定波长的选择
取对照品溶液，以二极管阵列检测器测定紫外光谱图，结果在230，320，386
nm处均有较强吸收，虽检测灵敏度较高，但测定辛芩胶囊时杂质干扰大。

在390 nm波长处，马兜铃酸Ⅰ出峰位置，方中其他成分对测定无干扰，因此选用该波长为测定波长。

3.2 提取方法的选择
由于中药成方制剂处方复杂，前处理往往干扰测定，因此相关成分的提取前处理过程至关重要。

本试验曾采用超声、回流、超声萃取、回流萃取等方法提取马兜铃酸Ⅰ，所得的供试品溶液中杂质较多。

据文献报道，殷书梅等［4］采用PAX固相
萃取小柱纯化供试品溶液，富集马兜铃酸Ⅰ。

唐秀玲等［5］采用Strata X－
AW33u(Phenomenex，60 mg/3 mL)固相萃取小柱提取纯化马兜铃酸Ⅰ。

本实
验以Polymer SAX Box(Agilent，60 mg/3 mL)固相萃取小柱分别对超声、回流、
超声萃取、回流萃取提取液进行萃取，实验结果基本一致。

由于超声提取操作简单，故采用超声提取方法进行提取、过固相萃取小柱精制的方法，制备供试品溶液。

《中国药典》中马兜铃酸Ⅰ的测定采用的是梯度洗脱，本试验采用的等度洗脱，在马兜铃酸Ⅰ出峰位置无干扰且出峰时间比较短，对马兜铃酸Ⅰ的含量测定进行了简化。

上述测定结果证明:细辛中的马兜铃酸Ⅰ没有转移到辛芩胶囊中，由于细辛药材中
马兜铃酸Ⅰ的含量较低或制剂是通过水煎煮制备而成。

由于马兜铃酸Ⅰ具有严重的肝、肾毒性，所以在含有马兜铃酸Ⅰ的中成药中，应当补充和制订马兜铃酸Ⅰ的限量检查，控制中药制剂的质量，以保证临床用药的安全性。

参考文献:
【相关文献】
［1］Xie ZM，Li SX，Liao HC.Determination of aristolochic acid A in Herba A sari by HPLC ［J］.Central South Pharm，2003，1(3):165－167.
［2］王瑛，潘竞先，高建军，等.中药关木通中的抗肿瘤成分研究［J］.北京医科大学学报，2000，32(1):18.
［3］葛孝忠，张跃平，蔡旭萍，等.辛芩颗粒中马兜铃酸A的UPLC法限度检查［J］.中国医药工
业杂志，2010，41 (8):604－606.
［4］殷书梅，王宓，林新艳，等.UPLC法测定复方南星止痛膏中马兜铃酸A的含量［J］.南京中
医药大学学报，2009，25(5):396－397.
［5］唐秀玲，何颂华，谢谭芳.SPE－HPLC法测定消肿止痛酊中马兜铃酸A的含量［J］.药物分
析杂志，2012，32(9): 1690－1693.。