【优秀版】球蛋白的分离纯化与鉴定PPT
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三、操作步骤
1.盐析：分离球蛋白与清蛋白
取血清0.75 ml，缓慢滴入饱和(NH4)2SO4溶液 0.75 ml， 边加边摇，混匀后于室温中放置10分钟，然后10000rpm 离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加蒸馏水0.4 ml， 使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
（2）浓缩
将纯化的-球蛋白溶液量体积，每毫升加葡聚糖凝胶G-25 干胶，摇动2-3分钟，离心5分钟（10000r/min）， 上清即为浓缩的-球蛋白溶液，留待电泳鉴定。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
4.电泳：鉴定-球蛋白及纯度 （比较纯化前后的蛋白质）
• 装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有
关注意事项同前述。
留少量做电泳
•上样前DEAE-纤维素柱的平衡：装柱后用0.02 M乙酸铵 （）冲洗2遍。
• 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE-纤维素阴离子交换柱 上，用乙酸铵洗脱，样品进入柱床后立即开始收集洗脱液 ， 检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。 •此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。
三、操作步骤
2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐 （脱盐）
（1）装柱：
（a）固定层析柱，保持垂直。 （b）排气，并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。 （c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打
开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 许溶液。关闭出口。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
二、实验原理
（三）如何分离得到纯化的-球蛋白？
• 因、球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合，
直接从层析柱流出。 • 故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分
蛋白质即为纯化的-球蛋白。
（四）如何鉴定-球蛋白及纯度？
小心加入少量乙酸铵（约1ml）洗层析柱内壁上的样品， 打开出口，使溶液进入凝胶
仔细清洗试管
加入适量乙酸铵溶液开始洗脱并收集洗脱液，每分钟收集15滴
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤 （3）洗脱液中蛋白质的检测：
• 按洗脱液的管号顺序分别取1滴液体，滴于玻片上，滴加 20％磺基水杨酸1滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，
• 避免气泡、纹路，凝胶面始终低于液面。 • 如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉
降，使表层平整。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤 （2）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面
使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面
用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上
淡黄色
然后打开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口
由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。
• 合并蛋白含量高的各管，此即已脱盐的球蛋白溶液，
除留少量作电泳鉴定用外，其余用于DEAE-纤维素阴离子
交换柱。
最多合并三管即可
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
3.离子交换层析：将-球蛋白与、-球蛋白分离。
（1）装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测
每组取醋酸纤维素薄膜3张，按如下操作：
须重复点样 不可重复点样
样品：(1)血清；(2)凝胶层析脱盐后的球蛋白溶液； (3)DEAE-纤维素阴离子交换柱纯化后的-球蛋白液
须重复点样， 约15次左右
电泳及染色：方法同醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验。 （点样面朝下、点样端靠近负极，氨基黑10B染色）
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
注意：
• 葡聚糖G-25 和DEAE纤维素：实验结束 后，用乙酸铵冲洗3遍后，回收至原烧 杯。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
四、结果分析
比较电泳结果，然后作出分析。
谢谢观看
球蛋白的分离纯化与鉴定
Contents
1 实验目的与要求 2 实验原理 3 操作步骤 4 结果分析
（三）如何分离得到纯化的 -球蛋白？ 血清 -球蛋白的分离、纯化及鉴定 盐析：分离球蛋白与清蛋白 20％磺基水杨酸1滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。 球蛋白的分离纯化与鉴定 开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。 柱内留下约5ml乙酸铵。 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 血清 -球蛋白的分离、纯化及鉴定 球蛋白的分离纯化与鉴定 使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。 （2）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面
4.电泳：鉴定-球蛋白及纯度。 因 、 球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合。
用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上 按洗脱液的管号顺序分别取1滴液体，滴于玻片上，滴加 如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉 血清 -球蛋白的分离、纯化及鉴定
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
（三）如何分离得到纯化的 -球蛋白？ 而 -球蛋白带正电荷而不与DEAE纤维素进行交换结合，
开因底部 、出3口球.，蛋离凝白胶带子随负柱电交内荷溶而换液与慢D层E慢A流E析纤下维而：素均进匀将行沉交降换，-结不球合断。加蛋入 白与、-球蛋白分离。
球蛋白的分离纯化与鉴定 （c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打
• 纯化前后的-球蛋白可用电泳法进行比较鉴定。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
二、实验原理
球蛋白的1分.离盐纯化析与鉴：定 分离球蛋白与清蛋白。
（）冲洗2遍。 20％磺基水杨酸1滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。
比上较，电 用泳乙2结酸.果铵凝，洗然脱胶后，作样层出品分进析析入。柱：床后去立即除开始球收集蛋洗脱白液，中的无机盐（脱盐）。
1.盐析：分离球蛋白与清蛋白
取血清0.75 ml，缓慢滴入饱和(NH4)2SO4溶液 0.75 ml， 边加边摇，混匀后于室温中放置10分钟，然后10000rpm 离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加蒸馏水0.4 ml， 使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
（2）浓缩
将纯化的-球蛋白溶液量体积，每毫升加葡聚糖凝胶G-25 干胶，摇动2-3分钟，离心5分钟（10000r/min）， 上清即为浓缩的-球蛋白溶液，留待电泳鉴定。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
4.电泳：鉴定-球蛋白及纯度 （比较纯化前后的蛋白质）
• 装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有
关注意事项同前述。
留少量做电泳
•上样前DEAE-纤维素柱的平衡：装柱后用0.02 M乙酸铵 （）冲洗2遍。
• 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE-纤维素阴离子交换柱 上，用乙酸铵洗脱，样品进入柱床后立即开始收集洗脱液 ， 检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。 •此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。
三、操作步骤
2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐 （脱盐）
（1）装柱：
（a）固定层析柱，保持垂直。 （b）排气，并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。 （c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打
开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 许溶液。关闭出口。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
二、实验原理
（三）如何分离得到纯化的-球蛋白？
• 因、球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合，
直接从层析柱流出。 • 故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分
蛋白质即为纯化的-球蛋白。
（四）如何鉴定-球蛋白及纯度？
小心加入少量乙酸铵（约1ml）洗层析柱内壁上的样品， 打开出口，使溶液进入凝胶
仔细清洗试管
加入适量乙酸铵溶液开始洗脱并收集洗脱液，每分钟收集15滴
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤 （3）洗脱液中蛋白质的检测：
• 按洗脱液的管号顺序分别取1滴液体，滴于玻片上，滴加 20％磺基水杨酸1滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，
• 避免气泡、纹路，凝胶面始终低于液面。 • 如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉
降，使表层平整。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤 （2）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面
使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面
用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上
淡黄色
然后打开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口
由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。
• 合并蛋白含量高的各管，此即已脱盐的球蛋白溶液，
除留少量作电泳鉴定用外，其余用于DEAE-纤维素阴离子
交换柱。
最多合并三管即可
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
3.离子交换层析：将-球蛋白与、-球蛋白分离。
（1）装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测
每组取醋酸纤维素薄膜3张，按如下操作：
须重复点样 不可重复点样
样品：(1)血清；(2)凝胶层析脱盐后的球蛋白溶液； (3)DEAE-纤维素阴离子交换柱纯化后的-球蛋白液
须重复点样， 约15次左右
电泳及染色：方法同醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验。 （点样面朝下、点样端靠近负极，氨基黑10B染色）
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
注意：
• 葡聚糖G-25 和DEAE纤维素：实验结束 后，用乙酸铵冲洗3遍后，回收至原烧 杯。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
四、结果分析
比较电泳结果，然后作出分析。
谢谢观看
球蛋白的分离纯化与鉴定
Contents
1 实验目的与要求 2 实验原理 3 操作步骤 4 结果分析
（三）如何分离得到纯化的 -球蛋白？ 血清 -球蛋白的分离、纯化及鉴定 盐析：分离球蛋白与清蛋白 20％磺基水杨酸1滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。 球蛋白的分离纯化与鉴定 开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。 柱内留下约5ml乙酸铵。 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 血清 -球蛋白的分离、纯化及鉴定 球蛋白的分离纯化与鉴定 使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。 （2）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面
4.电泳：鉴定-球蛋白及纯度。 因 、 球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合。
用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上 按洗脱液的管号顺序分别取1滴液体，滴于玻片上，滴加 如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉 血清 -球蛋白的分离、纯化及鉴定
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
（三）如何分离得到纯化的 -球蛋白？ 而 -球蛋白带正电荷而不与DEAE纤维素进行交换结合，
开因底部 、出3口球.，蛋离凝白胶带子随负柱电交内荷溶而换液与慢D层E慢A流E析纤下维而：素均进匀将行沉交降换，-结不球合断。加蛋入 白与、-球蛋白分离。
球蛋白的分离纯化与鉴定 （c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打
• 纯化前后的-球蛋白可用电泳法进行比较鉴定。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
二、实验原理
球蛋白的1分.离盐纯化析与鉴：定 分离球蛋白与清蛋白。
（）冲洗2遍。 20％磺基水杨酸1滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。
比上较，电 用泳乙2结酸.果铵凝，洗然脱胶后，作样层出品分进析析入。柱：床后去立即除开始球收集蛋洗脱白液，中的无机盐（脱盐）。