南海七种海藻多糖的抗病毒活性初步研究

病 毒 学 报 CHIN ESE J OU R NA L O F V IRO LOG Y
Vol. 22 July
N o. 4 2 0 ห้องสมุดไป่ตู้6
南海七种海藻多糖的抗病毒活性初步研究
张颖1 , 岑颖洲* 1 , 黄日明 1 , 李药兰1 , 张美英 2
( 暨南大学 1 化学系 2 生物医药研究开发基地 , 广东 摘要 : 采用体外细胞培养技术 , 对 南海 7 种 海藻 多糖 体外 抗单 纯疱 疹 广州 510632)
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。因硫酸酯多糖高效低毒 , 所以具有很大的开
发潜力。此文 研究的大型经济 海藻如绿藻门 孔石 莼、 刺松藻 , 褐藻门的海带、 亨氏马尾藻 , 红藻门的小 石花菜、 龙须菜、 蜈蚣藻等 , 均采自广东汕头南澳岛 , 上述海藻在南海海域的资源十分丰富。近年来研究 表明 , 以上海藻多糖具有抗肿瘤、 抗凝血、 免疫功能
4期
张颖等 : 南海七种海藻多糖的抗病毒活性初步研究 3 3 3 多糖总硫酸基含 量测定 多糖中总硫酸基含量。
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采用氯化钡 - 明胶法测 定
( F 株 , 美 国 AT CC V R733) ; 柯 萨 奇 病 毒 B 组 3 型 , 简 称 Cox B3( 武汉大学医学院病毒研究所提供 ) 。 3 3 1 倍 , 90 实验方法 多 糖 样品 的制 备 称取 每种 海藻 干品 5 0g , 加水 40
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材料与方法
1 试 剂及仪器 样品有孔石莼、 刺松藻、 海带、 亨 氏马尾藻、 小石花菜、 龙 须菜、 蜈 蚣藻 , 由 中 国科 学院 海 洋研 究所 夏 邦 美、 丁兰平教授 鉴定 , 现 保存在 中国科 学院青 岛海洋 研究 所 海藻标本室。主要试剂有阿昔洛韦 ( Acyclo vir) 简称 A CV ( 湖 北科益药业股 份有限 公司 ) ; 病 毒唑 ( Ribavirin inject ion) ( 广 州市市桥药业有限公司 生产 ) ; DM EM 培 养液 ( 美国 Hy clone 公司 ) ; 小牛血清 ( 杭州四季青公司 ) ; 胎牛血清 ( G ibco 公 司 ) ; 四甲基偶氮唑盐 , 简称 M T T ( 美国 SIGM A 公司 ) ; 十 六烷 基 磺酸钠 , 简称 SDS( 美 国 Promega 公司 ) ; N -2 - 羟 乙基 哌嗪 -N 2 -乙 烷磺酸 , 简 称 HEPES ( 美 国 Amresco 公司 ) ; PBS 磷酸 盐 生理缓冲 液 , 简称 PBS; 双蒸纯 水 ; 三氟乙酸 、 甲 醇、 异丙醇、 吡啶、 盐酸羟胺、 醋酸酐 ; 三氯乙酸、 氯化钡、 明胶。标准单 糖 有D - 甘露糖 ( A R) 、 D - 半 乳糖 ( 生 化试 剂 ) 、 D - 葡 萄糖 ( CARB 8CHEM SERV ICE ) 、L - 鼠 李 糖 ( CARB - 16 CHEM SER V ICE) 、 L - 岩藻糖 ( SIG MA ) 、 D - 果糖 ( 生 化试 剂 BR) 、 D -木糖 ( 生化试剂 BR) 、 D - 核 糖 ( 化学试 剂 ) 、 阿拉 伯糖 ( 生 化试剂 ) 。 主要仪器有 CO2 培养箱 ( 日 本 Sanyo 公司 ) ; 超净 工作台 ( 苏 州净化设备公司 ) ; 相差显微镜 ( 德国 L aica 公司 ) ; 酶标仪 ( 美 国 BI O - RAD 公 司 ) ; 气 质 联 用 仪 ( 美 国 T hermo Finnigan T race 型 ) ; 红外光谱仪 ( 德 国 BRU K ER 公司 EQ U IN OX- 55 型) 。 2 细胞 和 病 毒 细 胞 非 洲 绿 猴 肾细 胞 , 简 称 V ero ( 美 国 型 , 简称 HSV -1 AT CC CCL 81) ; 人宫 颈肿瘤细胞 , 简称 HeL a( 武汉大学医 学 院病毒研究所提供 ) 。病毒 : 单纯疱疹病毒
此外海藻多糖的抗病毒活性还可能与其它因多糖对hsv和coxb3均有抑制作用其中孑l素有关如多糖的分子量范围硫酸酯键类型多糖多糖和蜈蚣藻多糖有明显的抑制单纯疱疹工型病毒的立体结构以及分子的柔韧性等这还有待进一步引起细胞病变作用cc50均达390弘gml孑l石莼的研究
第 22 卷 第4 期 2 0 0 6 年 7 月
型 病毒 ( HSV - 1) 和 柯萨 奇 B 组 3 型病 毒
( Cox B3) 活性进行研究。 7 种海 藻多糖 均表 现出良 好的 抗病 毒活性。 其中 , 孔石 莼 多糖、 蜈 蚣藻 多糖 可明 显抑 制 HSV - 1, 细胞病变半数抑制浓度 ( IC 50) 均为 3 90 g / mL , 选择指数 ( SI ) 分别达 363 和 296 4 。孔石莼多糖、 小石花 菜 多糖 可明显抑制 Cox B3 , IC 50分别 为 1 95 g/ mL 和 7 81 g / mL , SI 分别为 > 1 025 6 和 212 。同时 理化实 验结果 表 明 , 多糖样品均为硫酸酯多糖 , 其硫酸基和岩藻糖的含量与多糖的抗病毒效果密切相关。 关键词 : 海藻多糖 ; 抗病毒 ; 理化性质 中图分类号 : R373 1+ 1 文 献标识码 : A 文章编号 : 1000- 8721( 2006) 04- 0282- 04
表 2 海藻多 糖抗 CoxB3 病 毒的 CC50、 IC50及 SI T able 2 Anti CoxB 3 activities of algae polysacchar ides
多糖样品 Polysaccharide sample 海带 褐藻门 Phaeophy ta Laminaria jap oni ca A resch 亨氏马尾藻 Sargassum henslow ianum C 绿藻门 Chlorophy ta 孔石莼 Ul va p ertusa K jellm 刺松藻 Codium f ragil e ( Sur ) Hario 小石花菜 G elidium divaricat um Mart ens 红藻门 龙须菜 蜈蚣藻 Agardh CC 50 IC50 ( g/ mL) ( g/ mL) > 2000 > 2000 > 2000 1840 1656 1385 1129 31 25 15 62 SI > 64 > 128
海藻多糖抗 HSV - 1 病毒的 CC50 、 IC50及 SI T able 1 A nti HSV - 1 activ ities of algae polysaccharides
多糖样品 Po ly saccharide sam ple 海带 褐藻门 Laminaria j ap onica A resch 亨氏马尾藻 Sargassum henslow ianum C 孔石莼 绿藻门 Ulv a p ert usa K jellm 刺松藻 Codium f ragile ( Sur ) Hario 小石花菜 Gelidium div aricatum Martens 红藻门 龙须菜 蜈蚣藻 G rateloup ia f ilicina ( L ) C A g ACV Rhodophyta G racilaria lemaneif ormis (Bory) W v B Agardh CC50 IC50 ( g / mL ) ( g / mL ) 2000 1488 1417 2000 1353 1583 1156 15 62 15 62 3 90 15 62 SI 128 95 363 128
Phaeophy ta
Chlorophy ta
31 25 43 3 62 5 3 90 0 3 25 3 296 4
海藻多糖在 Vero 细胞内抗 HSV - 1 结果: 以上 7 种海藻多糖对 H SV - 1 均有一定抑制作用, 其中, 孔 石莼多 糖和蜈 蚣藻 多糖 IC50 更 达到 3 90 g/ mL。 以上 海 藻 多 糖 对 细 胞 的 毒 性 也 较 小, CC50 均 在 1000 g/ mL 以上。 2 海藻多糖在 HeLa 细胞内抗 CoxB3 活性 ( 见表 2)
收稿日期 : 2005- 11- 24; 修回日期 : 2006- 03- 01 基金项目 : 广东省 十五 重大科 技专项 ( 2002A3050503) , 广东 省自然科学基金研究团队项目 粤科基办 [ 2003] 11 号 - 039213 作者简 介 : 岑 颖洲 , 男 , 教 授 , Tel: 86 -20 -085223420 , E -mail: of x@ jnu edu cn
,
所致病毒性心肌炎在 3 个月内的新生儿感 染率为 360/ 10 万, 病死率为 8% , 给人类带来极大威胁。目 前病毒唑为广谱抗病毒药 , 对 CoxB3 引起的感染有 抑制 作 用, 但 毒 副 作 用 大 [ 2] 。因 此 研 制 开 发 抗 HSV - 1 和 CoxB3 的药物具有现实意义。 研究表明, 硫酸酯多糖是被膜病毒强有力的抑 制剂 , 其作用机制与干扰病毒和细胞的吸附, 阻止病 毒进入细胞、 抑制逆转录酶活性、 抑制合胞体形成有 关
单纯疱疹病毒 型 ( herpes simplex virus, HSV 1) 主要侵犯外胚层来源的组织 , 包括皮肤、 粘膜和神 经组织 , 引起如唇疱疹, 疱疹性角膜炎等多种疾病。 单纯疱疹病毒增殖速度快 , 并有潜伏感染的趋向, 严 重威胁人类健 康
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调节等多方面活性 , 但对它的抗 HSV - 1 和 CoxB3 病 毒活性研究国内外报道较少。此文旨在研究以上海 藻多糖体外对 HSV - 1 和 CoxB3 的作用及其细胞毒 性 , 并探讨部分理化指标与抗病毒活性之间的联系, 为开发海藻多糖药物提供依据。
结
1
表1
果
水浴提取 2 次 , 过滤 后合并 滤液 , 浓 缩 , 加 无水 乙醇
至最终体积分数为 75% , 沉淀 分别 用丙 酮、 乙 醇清 洗 , 透析 后冷冻干燥 , 得海藻多糖样品。 3 2 3 2 1 体外抗病毒实验 [ 45]
海藻多糖在 Vero 细胞内抗 HSV -1 活性 ( 表 1)
细胞的培养与增殖
取出 - 80 下冻存的细 胞进行 10 ml。细胞接种
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复苏。处于 对数生长期的细胞在消化后用 DM EM 生长液稀 释 , 使其密度在细胞计数板中计数为 2 5 长成单层细胞。 3 2 2 多糖 的 细胞 毒 性测 定 待 接种 于 96 孔 培 养板 的 HeLa 或 V ero 细 胞长 成 单层 后 , 加 入各 样 品 的对 倍 稀释 液 100 l/ 孔 ( 7 个浓度梯 度 , 每个稀释度设 4 个平行 ) , 同 时设正 常细胞对照组 ( 加 100 l 的 DM EM 维 持液 ) 、 阳性 对照组 ( 阿 昔洛韦或病毒唑对倍稀 释后加 入 ) 。加 样后 的 96 孔板 置于 37 、 5% CO2 培养箱中培 养 48h, 每天 观察 , 记录 各浓 度孔 、 细胞毒性 情况。每孔 加入 5mg/ mL M T T 10 l, 置于培 养箱 中 4 h, 弃孔中培养液 , 每孔加入 10% SDS 100 l, 置于 37 5% CO2 培养 箱中培养 8h, 用酶 标仪 测定 OD 值 , 测量 波长 为 570nm, 参比波长为 630nm, 计算多 糖样 品对细 胞的 半毒 性浓度 ( Cytotox ic Concentration, 简称 CC 50, g/ mL ) 及 无毒 界 限 浓 度 ( M aximal N on - cytotox ic Concentr at ion, 简 称 M NCC, g/ mL) , 并计 算细 胞存 活率 ( 细胞 存活 率 ( % ) = 样 品孔 OD/ 对照孔 OD 3 2 3 100%) 。 将长 有 单层 细 胞的 多糖的体 外抗 病毒 活性 初筛 于 96 孔板中 , 每孔 100 l, 于 37 、 5% CO2 培 养箱中培 养至
。目前治疗 单纯疱疹病毒 主要
使用各种洛韦类抗病毒药 , 但易出现耐药毒株 。 柯萨 奇 病 毒 B 组 3 型 ( coxsackie B3 virus, CoxB 3) 引起的多种疾病可出现隐性感染、 急性感染 和急性暴发性感染而猝死, 这些感染可引起流行性 胸痛、 无 菌 性 脑 炎、 脑 膜 炎、 心 肌 炎 和 克 山 病。 CoxB 3 已经被证实是病毒性心肌炎主要病原体