延边地区膝骨性关节炎患者滑膜组织基因谱的表达

延边地区膝骨性关节炎患者滑膜组织基因谱的表达
任红革;李林;李振浩;孙培磊;崔逢德
【摘要】10.3969/j.issn.2095-4344.2012.46.007% 背景：原发性骨性关节炎的发展是多种相关基因表达失常的缘故。

采用 mRNA 基因表达谱芯片技术，检测膝关节骨性关节炎滑膜差异表达基因，有助于阐明骨性关节炎病理过程的相关机制。

目的：比较延边地区膝关节骨性关节炎和正常关节滑膜的基因表达谱变化，筛选出与膝关节骨性关节炎相关的差异表达基因，并探讨其在骨性关节炎发病机制中的意义。

方法：选择延边地区原发性膝关节骨性关节炎患者9例及正常对照者3例，应用 mRNA 基因表达谱芯片技术检测所获得的滑膜组织中表达差异的基因，筛选出表达差异基因并对其进行 GO 分析。

结果与结论：膝关节骨性关节炎及正常对照者滑膜的差异表达基因分析结果显示，延边地区膝关节骨关节炎滑膜中的差异表达基因共有1261个，其中上调的基因有451个，下调的基因有810个。

差异表达基因 GO 统计分析显示，信号转导、翻译调节、趋化作用、炎症应答、细胞增殖等多种基因的表达有差异。

基因芯片技术能有效地筛选出骨性关节炎差异表达的基因，并进一步证实了骨性关节炎的病理过程是多种功能基因参与的复杂的病理过程。

【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2012(000)046
【总页数】6页(P8583-8588)
【关键词】骨性关节炎;基因芯片;膝关节;滑膜;信号转导;翻译调节;趋化作用;炎症应答;细胞增殖;差异表达
【作者】任红革;李林;李振浩;孙培磊;崔逢德
【作者单位】延边大学附属医院骨 1 科,吉林省延吉市 133000;延边大学附属医院骨 1 科,吉林省延吉市 133000;延边大学附属医院骨 1 科,吉林省延吉市 133000;延边大学附属医院骨 1 科,吉林省延吉市 133000;延边大学医学部,吉林省延吉市133000
【正文语种】中文
【中图分类】R318
0 引言
骨性关节炎是由遗传、环境、生活习惯及职业等多因素作用而引起的退行性疾病，在50岁以上的人群中，骨性关节炎可导致长期残疾，最终致死率达53%[1]。

在骨性关节炎老化的软骨中，胶原纤维和糖化作用终末产物的交联显著增加，使这种老化软骨变成更脆弱和易受损伤而关节结构受破坏[2-3]。

有大量的证据显示滑膜炎在骨性关节炎的发展中起作用，发炎的滑膜释放炎性递质和分解递质，最终引起关节组织的破坏[4]，但其病因及机制尚未完全明确。

目前对骨性关节炎病因、发病机制的研究已进入分子水平，认为骨性关节炎的发生和发展是多种相关基因表达失常的缘故[5]。

作者利用基因芯片技术对延边地区膝关节骨性关节炎及正常滑膜进行表达差异基因的表达谱分析，探讨表达差异基因与骨性关节炎发病的相关性及其机制，为骨性关节炎的病因、地域差异及进一步的治疗提供科学依据。

1 对象和方法
设计：病例-对照分析。

时间及地点：实验于2011年3月至2012年4月在延边大学病理学教研室完成，
基因芯片检测委托北京博奥生物有限公司完成。

对象：
诊断标准：根据美国风湿协会标准：具有膝痛及患膝X射线检查示形成骨赘；受累膝关节晨僵＜30 min；有骨擦音，近1个月内大多数时间有膝关节疼痛。

纳入标准：选择在延边大学附属医院及延边第二人民医院作人工全膝关节置换的原籍为延边地区的年龄＞50岁的原发性膝关节骨性关节炎患者。

按照Ahlback膝关节骨性关节炎分级标准：①关节间隙狭窄(50%关节软骨磨损)。

②关节间隙消失。

③轻度骨磨损。

④中度骨磨损(磨损0.5-1.0 cm)。

⑤严重骨磨损及关节半脱位，选择符合②，③，④标准的患者，并选择相应年龄段创伤后截肢患者的新鲜膝关节软骨标本作为对照组。

排除标准：原籍不在延边地区，并排除继发性骨性关节炎。

9例骨性关节炎患者均为2011年1月至2012年1月延边大学附属医院骨科行人工全膝关节置换患者，男3例，女6例，年龄为62-76岁，取其膝关节滑膜标本作为骨性关节炎患者组实验标本，无骨性关节炎病史、创伤性截肢患者3例，年龄48-56岁，取其膝关节滑膜组织作为正常组标本，所有标本离体后置入冻存管于液氮中存放30 min后，存于-70 ℃低温冰箱中冻存。

膝关节骨性关节炎滑膜组织的基因表达谱分析需用试剂及仪器：
试剂及仪器来源RealTime PCR system紫外分光光度计ND-1000 TRIzol RNA 提取试剂盒、M-MLV反转录酶dNTP Rnase抑制剂RNA扩增试剂盒RNA纯化试剂盒芯片采用NimbleGen 真核生物表达谱芯片、该芯片覆盖人类基因22886个、MS 200 微Applied Biosystems NanoDrop Invitrogen公司Takara公司Promega公司Ambion公司MACHEREY-NAGEL,Germany Roche 公司
实验方法：
总RNA的提取及纯化：组织放入用液氮预冷的研钵中进行研磨，按每100 mg组
织加入1 mL TRIzol，继续研磨至较细粉末，按0.2 mL氯仿：1 mL TRIzol的比
例加入氯仿，漩涡震荡30 s混匀，室温放置2.0-3.0 min，4 ℃，12 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心15 min，上清液移至一新Eppendorf管中，按0.5 mL
异丙醇∶1 mL TRIzol的比例加入异丙醇，混匀，-20 ℃放置10 min以上，4 ℃，12 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心15 min。

弃去异丙醇，加入1 mL体积
分数75%乙醇，颠倒几次，4 ℃，7 500 r/min，离心半径13.5 cm，离心5 min，弃去体积分数75%乙醇，超净台中自然干燥15-30 min，加入一定体积的Nuclease-Free Water，65 ℃ 5-10 min助溶。

DNaseⅠ消化基因组DNA，补Nuclease-Free Water使消化纯化后Total RNA溶液总体积为100 μL，100 μL Total RNA溶液移至RNA结合柱收集管中，和300 μL RLT充分混匀，加入300 μL无水乙醇，充分混匀，并将上述混合液移至RNA结合柱中,室温，12 000
r/min，离心半径13.5 cm，离心15 s，将RNA结合柱移至新的收集管上，加入500 μL RPE，室温，12 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心15 s，倒掉收集管中的废弃液，加入500 μL体积分数80%乙醇，室温，12 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心2 min，将RNA结合柱移至新Eppendorf管中，加入16 μL Nuclease-Free Water至结合柱硅胶膜上，室温，10 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心1 min，再加入16 μL Nuclease-Free Water H2O至结合柱硅胶膜上，室温，10 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心1 min。

用NucleoSpin® R NA clean-up 试剂盒(MACHEREY- NAGEL，Germany)对总RNA进行过柱纯化，最后用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。

NimbleGen 真核生物表达谱芯片检测：以Total RNA为模板，
T7Oligo(dT)Primer 为引物，反转录合成1st-strand cDNA。

用RNase H 将杂
合链中的RNA 切成短片段，DNA Polymerase I以RNA 短片段为引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA。

以cDNA为模板，体外转录合成
cRNA，然后纯化定量。

取5 μg cRNA反转录，反转录产物，以Random Primer为引物进行Klenow酶(Cy3-dCTP)标记，将标记好的样品与杂交buffer
混匀后，注到已经与相应mixer粘合的芯片上，采用Roche NimbleGen 杂交仪42 ℃杂交14-16 h，清洗芯片，甩干，使用Roche-NimbleGen MS200 扫描仪
扫描芯片。

采用NimbleScan进行图像分析，将图像信号转换为数字信号。

用SAM(Significance Analysis of Microarrays)软件进行分析，筛选差异基因的标准为：FDR(False Discovery Rate)控制在5%以内，Fold Change控制在2倍以上。

主要观察指标：①总RNA提取结果。

②两组患者基因表达散点图分析。

③基因芯片检测结果。

2 结果
2.1 总RNA提取结果结果显示样品总RNA的A260/280≥1.80，RNA总量≥8 μg，经甲醛变性胶电泳检测，样品电泳18S与28S条带清晰，28S:18S rRNA条带亮度大于或接近2∶1，见图1。

Figure 1 Electrophoretogram of total RNA extracted from the synovial tissue of patients with knee osteoarthritis and health controls图1 膝关节骨性关节炎滑膜组织及正常膝关节滑膜总RNA提取电泳图
2.2 两组患者基因表达散点图分析见图2。

Figure 2 Scatter plots of gene expression analysis in the osteoarthritis and normal groups图2 正常组与骨性关节炎组基因表达比较分析散点图
设R=S/C(S代表纵坐标上归一化后的样本数据，C代表横坐标上归一化后的样本
数据)，其中红色的点代表R≥2，即S相对C表达上调大于2倍的基因，绿色的点代表R≤0.5，即S相对C表达下调小于0.5倍的基因，黑色的点表示0.s5＜R＜2，即S相对C无明显差异表达的基因。

从图2中可直观地看出，骨性关节炎组较正
常组均有大量基因发生了上调或下调表达。

可以比较直观地看出在两个样品之间基
因表达的差异情况。

2.3 基因芯片检测结果
2.3.1 差异表达基因从芯片杂交图片上看，杂交信号均一，划痕、气泡等瑕疵面
积不超过点阵面积的5%。

骨性关节炎组与正常组荧光信号强度比值≥2为上调，
≤0.5为下调，mRNA基因芯片所包含的22 885个基因中上调基因451个，下调基因810个，本研究中部分上调基因及部分下调基因分析见表1，2。

表1 骨性关节炎组和正常组滑膜组织部分上调基因Table 1 Partial upregulated genes in the synovial tissue of osteoarthritis group and normal group注：
骨性关节炎滑膜组织较正常滑膜组织，对同源异型盒基因10基因、肿瘤坏死因子超家族7基因、神经元鸟苷酸交换因子基因、免疫球蛋白超家族10基因、肿瘤坏死因子超家族9基因、整联蛋白A11基因表达升高，其信号强度比值明显大于2。

Gene GeneBank number Ratio HOXD10NM_00214817.304 1 NGEF
NM_019850 8.106 4 TNFSF7 NM_001252 6.937 1 IGSF10 NM_178822 5.594 7 TNFSF9 NM_003811 3.531 9 ITGA11 NM_001004 2.505 7
表2 骨性关节炎组和正常组滑膜组织部分下调基因Table 2 Partial downregulated genes in the synovial tissue of osteoarthritis group and normal group注：骨性关节炎滑膜组织较正常滑膜组织，对淋巴细胞抗原
CD79A基因、趋化因子CXCL13基因、白细胞介素1受体a基因、白细胞介素
24基因、胰岛素样生长因子2基因、成纤维细胞生长因子7基因表达明显下调，其信号强度比值小于0.5。

Gene GeneBank number Ratio
CD79ANM_0216010.030 7 CXCL13 NM_006419 0.032 4 IL-1Ra
NM_000417 0.280 7 IL-24 NM_006850 0.134 4 IGF-2 NM_000612 0.475
2 FGF-7 BC010956 0.499 9
2.3.2 差异表达基因GO统计分析挑选出的差异表达基因在MAS(Molecule
Annotation System)系统中进行了GO的统计分析。

结果展示了差异表达基因所
涉及到具有显著性意义的GO分类，部分与骨性关节炎相关的分子功能分析结果，见表3，P值的计算是通过下面超几何分布的概率公式完成，P值表示差异表达基因与这些功能有关的无效假设的概率值。

结果显示这种概率值都明显低，表明差异表达基因与上述分子功能有密切相关。

表3 骨性关节炎滑膜组织中部分差异表达基因的GO分析结果Table 3 GO analysis results of the part of differentially expressed genes in the osteoarthritis synovial tissue注： GO分析结果骨性关节炎与正常滑膜组织差异表达基因的分子功能主要与信号转导、翻译调节、趋化作用、炎症应答、细胞增殖、突触传递、血管再生等作用相关Item n P value Signal
transduction681.14×10-51 Translation regulation 35 1.12×10-23 Chemotactic effect 17 1.83×10-26 Infla mmatory response 14 1.27×10-16 Cell proliferation 14 1.24×10-10 Synaptic transmission 8 1.38×10-8 Vascular regeneration 6 1.70×10-7
3 讨论
骨性关节炎是老年患者中最常见的骨关节疾病，也是老年人中引起残疾的最常见原因之一[6-7] 。

骨性关节炎的主要特点是关节软骨的破坏、细胞外基质的减少、软骨下骨的改变和滑膜的炎性改变等。

骨赘的形成和软骨下骨的硬化是骨性关节炎的特征[8]。

骨性关节炎的分子基础包括肿瘤坏死因子，白细胞介素和基质金属蛋白酶等趋化因子的存在[9-10]，引起软骨的侵蚀和滑膜的炎症[11-12]，滑液细胞的增殖和骨髓
细胞的聚集引起滑膜的增生，骨性关节炎晚期关节腔内的滑膜长期受到刺激，呈绒毛状增生，侵蚀关节软骨面，破坏软骨和骨质，可加快病变进程，加重症状[13-
14]，在微环境中，物理化学改变的作用影响关节软骨的代谢[15-16]。

然而近年研究表明，骨性关节炎滑膜炎程度与关节软骨残骸和碎片刺激存在分离，原因不明, 骨性关节炎滑膜炎可能是目前不清楚的多种因素所导致。

因此,阐明骨性关节炎滑膜中表达异常的基因及其分子机制，对于深入理解骨性关节炎的发生与发展，具有重要的理论意义和临床指导作用。

由于基因芯片上所含的信息量大，可以同时检测到多至几万个基因的表达情况，其采集生物信息的特点优于其他传统的技术方法[17]。

罗氏NimbleGen基因表达谱芯片是集长寡核苷酸探针(-60mer)、超高密度(-4.2M)和高度灵活性为一体的基因芯片，罗氏NimbleGen利用光沉积化学技术，结合独家专利的无膜芯片原位合成技术来制作高密度DNA芯片，在控制系统输入DNA序列以后即可快速得到高密度、高重复性、高精度的长寡核苷酸芯片，等温设计的长寡核苷酸探针
(Tm=76 ℃)，有利于提高探针信号强度和灵敏度，可变的探针长度有利于Tm值优化，保证杂交结果稳定性，相对短探针，长探针能提供更好的信噪比。

该基因芯片产品的寡核苷酸探针序列均来自国际公认的NCBI数据库，本实验证明罗氏NimbleGen基因表达谱芯片具有良好的检测稳定性、灵敏度和重复性。

通过基因芯片检查发现延边地区膝关节骨性关节炎滑膜组织中较正常对照组有451个基因上调，810个基因下调。

上调基因中肿瘤坏死因子超家族7 及肿瘤坏死因子超家族9属于肿瘤坏死因子家族，肿瘤坏死因子在介导软骨基质的破坏，减少胶原和蛋白多糖的合成等作用中起重要作用，与骨性关节炎的发生、发展有密切相关[18-19]。

Sumihisa等[20]研究发现肿瘤坏死因子与疼痛有密切相关，本实验膝关节骨性关节炎滑膜组织中肿瘤坏死因子超家族7 及肿瘤坏死因子超家族9明显上调，提示延边地区膝关节骨性关节炎与肿瘤坏死因子基因的过表达有密切相关。

成纤维细胞生长因子不仅能促进软骨细胞的增殖，而且能加强胶原蛋白的合成，成
纤维细胞生长因子在骨性关节炎软骨修复中起积极的生物学效应[21-22]。

胰岛素样生长因子2能促进软骨细胞合成蛋白聚糖而形成软骨基质，在维持关节软骨的正常形态和功能中起重要作用[23]。

Ange等[24]研究显示胰岛素样生长因子1α通过上调缺氧诱导因子基因表达及缺氧诱导因子蛋白表达水平，对骨性关节炎患者的软骨起保护作用。

白细胞介素包括促炎性和抑制炎性白细胞介素，在骨性关节炎中起重要的作用，也是骨性关节炎治疗的潜在的靶点。

白细胞介素1β在骨性关节炎病理生理过程中是一个关键因素[25]。

白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α可促进软骨细胞对Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的分解代谢，白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α诱导基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的表达，激活血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整连蛋白金属蛋白酶5等聚蛋白多糖酶，促进一氧化氮合酶的表达和一氧化氮的产生，减少蛋白聚糖的合成[26-27]。

白细胞介素1受体拮抗剂作为白细胞介素1受体抑制剂，可抑制白细胞介素1在骨性关节炎的作用，实验中延边地区膝关节骨性关节炎成纤维细胞生长因子9，胰岛素样生长因子2，白细胞介素1受体拮抗剂基因表达均明显下调，表明延边地区膝关节骨性关节炎的发生于上述基因的下调密切相关。

差异表达基因GO统计分析显示，信号转导、翻译调节、趋化作用、炎症应答、细胞增殖等多种基因的表达有差异，提示骨性关节炎的病理过程是多种功能基因参与的复杂的病理过程，每个功能基因的作用机制，需要进一步的研究。

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