一种负载去甲斑蝥素外泌体的制备方法及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110047065.1
(22)申请日 2021.01.13
(71)申请人 广东药科大学
地址 510224 广东省广州市海珠区宝岗光
汉直街40号
(72)发明人 王婴　王岩　梁乐谊　赵玲　
郭密密　
(74)专利代理机构 北京精金石知识产权代理有
限公司 11470
代理人 王洋
(51)Int.Cl.
A61K 9/50(2006.01)
A61K 31/365(2006.01)
A61K 47/46(2006.01)
A61K 35/00(2006.01)
(54)发明名称
一种负载去甲斑蝥素外泌体的制备方法及
其应用
(57)摘要
本发明属于药学肿瘤药物新剂型领域，尤其
涉及一种负载去甲斑蝥素外泌体的制备方法及
其应用，方法具体步骤包括(1)采用超速离心法
提取骨髓间充质干细胞外泌体；(2)通过电穿孔
法将去甲斑蝥素包裹在所述外泌体内，得载药外
泌体。

本发明制得的载药外泌体能够提高药物的
肝靶向性以及增强去甲斑蝥素的药效。

权利要求书1页 说明书10页 附图22页CN 112773775 A 2021.05.11
C N 112773775
A
1.一种负载去甲斑蝥素外泌体，其特征在于，所述负载去甲斑蝥素外泌体包括骨髓间充质干细胞外泌体及包裹在骨髓间充质干细胞外泌体内的去甲斑蝥素。

2.根据权利要求1所述的负载去甲斑蝥素外泌体，其特征在于，将所述去甲斑蝥素包裹在骨髓间充质干细胞外泌体内的方法是电穿孔法。

3.根据权利要求2所述的负载去甲斑蝥素外泌体，其特征在于，所述的电穿孔法包括以下步骤：
(1)将含有所述去甲斑蝥素和所述骨髓间充质干细胞外泌体的PBS溶液混合；
(2)对上述PBS溶液进行电刺激，得到电转混合溶液；优选地，电刺激电压为0.50‑0.70mv；每隔25‑35s电击一次，共电击6‑10次；
(3)将电转混合溶液孵育，得负载去甲斑蝥素外泌体；优选地，所述孵育温度为35‑38℃，孵育时间为25‑35min；优选地，所述混合溶液经孵育后，超滤，得负载去甲斑蝥素外泌体。

4.根据权利要求3所述的负载去甲斑蝥素外泌体，其特征在于，步骤(1)中所述骨髓间充质干细胞外泌体与去甲斑蝥素的质量比为1:0.5‑2。

5.一种根据权利要求1‑4任意一项所述的负载去甲斑蝥素外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用超速离心法提取骨髓间充质干细胞外泌体；
(2)通过电穿孔法将去甲斑蝥素包裹在所述外泌体内，得负载去甲斑蝥素外泌体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超速离心法提取外泌体的步骤为：
(1)将骨髓间充质干细胞扩培，待细胞密度为80‑90％时，弃掉原含有血清的培养液，用PBS洗2‑3次，加入DMEM，饥饿培养45‑50h，收集含有外泌体的DMEM；
(2)将上述含有骨髓间充质干细胞外泌体的DMEM离心，得外泌体上清液；
(3)将上述外泌体上清液超速离心，取沉淀，加PBS重悬得纯化外泌体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的次数为3次，其离心具体步骤为：离心温度为2‑6℃；第一次200‑400g离心5‑20min，吸取上清液；第二次1000‑3000g离心10‑20min，取上清液；第三次8000‑12000g离心10‑40min，得外泌体上清液。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心为80000‑120000g 离心60‑80min，取出超速离心管，取沉淀；优选地，所述离心温度为2‑6℃。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述离心还包括第二次离心，于80000‑120000g离心60‑80min，取沉淀；优选地，离心的温度为2‑6℃。

10.一种根据权利要求1‑4任意一项所述的负载去甲斑蝥素外泌体或权利要求5‑9任意一项所述方法制备的负载去甲斑蝥素外泌体在制备治疗肝癌药物中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 112773775 A
一种负载去甲斑蝥素外泌体的制备方法及其应用
技术领域
[0001]本发明属于药学肿瘤药物新剂型领域，尤其涉及一种负载去甲斑蝥素外泌体及其制备方法。

背景技术
[0002]随着纳米技术的迅速发展，研究者们一直致力于开发能够显著提高药物靶向性的新型载体，如脂质体、纳米粒、纳米球等，这些载体利用其较小的粒径(<1μm)，可被网状内皮系统较丰富的器官所摄取，如肝、脾、骨髓等，从而形成被动靶向。

或者对其进行结构修饰或改造，使其对某些组织器官具有特殊的亲和力，以达到主动靶向效果。

然而，人们在经过大量的动物和临床试验后发现，纳米载体也存在诸多缺点：纳米载体作为外源性物质在穿透细胞膜前即有可能被非靶器官的免疫系统所摄取，从而降低其靶向效率；多数纳米载体并不是完全意义上的生物降解材料，具有一定的细胞毒性和免疫原性，且其残留物的潜在毒性仍有待考证[1]。

在药剂学领域中，细胞毒性低、靶向效率高的药物载体一直都是靶向递药系统研究亟待突破的瓶颈之一。

鉴于外源性载体的局限性，从生物体内探寻天然的载体或许可以解决这些问题。

[0003]细胞外泌体(exosome)是一种由真核细胞胞内多泡体与胞膜融合后分泌到细胞外环境中，具有磷脂双分子层的膜结构腔体，电镜下呈碟状小体形态。

不同来源的外泌体均含有其来源细胞的胞膜和胞质蛋白成分，较易与邻近细胞的胞膜发生不同方式的融合，进而将一个细胞的胞膜及胞质蛋白传递给另一个细胞，实现不同细胞间的信息传递。

有研究表明MSC‑Exo 可作为核酸或药物的传递载体。

其优势：一、由于外泌体特殊的膜结构使其具有生物相容性，可通过膜融合或内吞作用将药物传递到靶细胞；二、与典型的纳米系统(如脂质体、纳米粒) 不同，外泌体可以保护内容物避免巨噬细胞的吞噬和降解，并促进内容物在细胞内的摄取；三、由于外泌体是天然的细胞产物，可长时间在体内循环，提高药物的生物利用度。

此外，由于骨髓间充质干细胞对受损组织的归巢性，故其外泌体更容易迁移到损伤组织中，且研究表明骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体含有BMSCs表达的粘附分子，包括CD29、 CD44和CD73等，其中CD29即为肝细胞特异性蛋白。

因此，BMSCs外泌体对受损的肝脏具一定的“归巢”效应，但是还是存在一定的争议。

此外，另有研究表明，外泌体自身可通过调节免疫反应对人肝癌细胞的增殖产生显著抑制作用，这一发现已成为近年来非细胞性肿瘤疫苗研究的热点。

值得关注的是，细胞外泌体粒径仅为30～150nm，这使其具备了内源性纳米载体的基本特性。

此外，它还具有可避免非宿主巨噬细胞吞噬、无免疫原性和低细胞毒性等特点。

因此，外泌体被开发为一种新型的药物载体有待科学研究。

[0004]由于目前西药并无针对肝癌的特效制剂，研究者们不断探寻从中药及天然植物中寻找治疗肝癌的有效药物。

去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是由芜青科昆虫斑蝥的主要成分斑蝥素合成的一种较低毒性的衍生物(见图1)，对原发性肝癌、食管癌和胃癌等多种恶性肿瘤均有显著疗效。

目前用于临床的有片剂和注射液两种剂型，但由于其在人体内代谢快，需要频繁增加给药次数以维持药物浓度才能达到治疗效果，而大剂量的长期应用对
造血系统、泌尿系统等易产生严重的不良反应。

为了使去甲斑蝥素更好地发挥临床疗效，本课题尝试运用新型载体包裹去甲斑蝥素，使其在体内缓慢释放，可避免血药浓度峰值的出现，并利用新剂型靶向性的特性，充分发挥去甲斑蝥素的抗肿瘤活性并降低其毒副作用。

[0005]中国发明专利CN106974938B公开了一种具有抗肝癌作用的骨髓间充质干细胞来源的外泌体及其药物制剂，由骨髓间充质干细胞来源的外泌体经化合物负载制备而成，所述化合物为具有如下通式结构的此啶并咪唑类有机化合物：所述负载指将所述化合物导入外泌体内，但是并未阐述其释药性能，其药效有待进一步提高。

[0006]中国发明专利CN105412153B公开了间充质干细胞来源的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒(HCV)药物中的应用。

其制备方法包括外泌体的提取、浓缩和纯化。

[0007]中国发明专利申请CN111450061A公开了一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统, 所述药物递送系统由间充质干细胞外泌体和脂质体通过杂化融合构建而成。

[0008]去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是由芜青科昆虫斑蝥的主要成分斑蝥素合成的一种较低毒性的衍生物(见图1)，对原发性肝癌、食管癌和胃癌等多种恶性肿瘤均有显著疗效。

目前用于临床的有片剂和注射液两种剂型，但由于其在人体内代谢快，需要频繁增加给药次数以维持药物浓度才能达到治疗效果，而大剂量的长期应用对造血系统、泌尿系统等易产生严重的不良反应。

为了使去甲斑蝥素更好地发挥临床疗效，本发明运用新型载体包裹去甲斑蝥素，使其在体内缓慢释放，可避免血药浓度峰值的出现，并利用新剂型靶向性的特性，充分发挥去甲斑蝥素的抗肿瘤活性并降低其毒副作用。

发明内容
[0009]本发明的目的在于提供一种具有抗肝癌作用的以骨髓间充质干细胞作为载体包裹抗肝癌药物去甲斑蝥素，提高药物去甲斑蝥素的肝靶向性，并大大增强了去甲斑蝥素的疗效，降低了药物的毒副作用。

[0010]为解决上述技术问题，本发明提供一种负载去甲斑蝥素外泌体，包括骨髓间充质干细胞外泌体及包裹在骨髓间充质干细胞外泌体内的去甲斑蝥素。

[0011]优选地，上述去甲斑蝥素包裹在骨髓间充质干细胞外泌体内的方法是电穿孔法。

[0012]优选地，所述的电穿孔法包括以下步骤：
[0013](1)将含有所述去甲斑蝥素和所骨髓间充质干细胞外泌体的PBS溶液混合；[0014](2)对上述PBS溶液进行电刺激，得到电转混合溶液；
[0015]优选地，电刺激电压为0.5‑0.70mv；每隔25‑35s电击一次，共电击6‑10次；[0016](3)将电转混合溶液孵育得负载去甲斑蝥素外泌体；
[0017]优选地，将电转混合溶液于35‑38℃孵育25‑35min，超滤，得负载去甲斑蝥素外泌体。

[0018]优选地，步骤(1)中所述骨髓间充质干细胞外泌体与去甲斑蝥素的质量比为1: 0.5‑2。

[0019]本发明的另一目的是提供上述负载去甲斑蝥素外泌体的制备方法，具体包括如下步骤：
[0020](1)采用超速离心法提取骨髓间充质干细胞外泌体；
[0021](2)通过电穿孔法将去甲斑蝥素包裹在所述外泌体内，得负载去甲斑蝥素外泌体。

[0022]优选地，超速离心法提取外泌体的步骤为：
[0023](1)将骨髓间充质干细胞于培养皿里扩培，待细胞密度为80‑90％时，弃掉原含有血清的培养液，用PBS洗2‑3次，加入DMEM，饥饿培养45‑50h，收集含有外泌体的DMEM；[0024](2)将上述含有外泌体的DMEM离心，得外泌体上清液。

[0025](3)将上述外泌体上清液超速离心，取沉淀，加PBS重悬得纯化外泌体。

[0026]更优选地，步骤(2)中所述离心的次数为3次，其具体步骤为：离心温度为2‑6℃；第一次200‑400g离心5‑20min，吸取上清液；第二次1000‑3000g离心10‑20min，取上清液；第三次8000‑12000g离心10‑40min，得外泌体上清液。

[0027]优选地，步骤(3)中所述离心8000‑120000g，离心60‑80min，取出超速离心管，取沉淀。

[0028]优选地，步骤(3)中所述离心还包括第二次离心，于8000‑120000g离心60‑80min，取沉淀。

[0029]优选地，步骤(3)中两次离心温度为2‑6℃。

[0030]更优选地，上述载药外泌体的制备方法，还包括对纯化外泌体的鉴定：
[0031]首先采用western blot对外泌体表面标记蛋白CD9、CD81、ALIX、CD63和HSP70检测进行分析。

然后，通过透射电子显微镜(TEM)对外泌体进行形态学评价，最后采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)对外泌体的粒径大小和外泌体浓度进行检测。

[0032]本发明的再一个目的是上述载药外泌体在制备治疗肝癌药物中的应用。

[0033]本发明的优异的有益效果：
[0034](1)针对现有去甲斑蝥素剂型存在的载药量低、不稳定、无特异靶向性等问题，本发明涉及一种基于骨髓间充质干细胞外泌体包裹去甲斑蝥素治疗肝癌的制剂，通过制备新剂型提升了药物的靶向缓释性能；
[0035](2)提高药物的包封率：本发明限定了最佳的外泌体药物配比，提高了药物的包封率；药物浓度过低，药物难以寻找外泌体的瞬时孔洞，药物难以装载；而药物浓度过高，外泌体包裹去甲斑蝥素药物的通道有限，药物进入外泌体存在竞争性，导致药物难以装载，包封率低。

[0036](3)疗效更高，安全性更好：通过药效学研究，本发明负载去甲斑蝥素外泌体显著提高了体内外抗肝癌作用并增强肝癌的归巢性，并可以抑制肿瘤增长，大大提高了去甲斑蝥素的药效，并与去甲斑蝥素普通剂型相比，无肝、肾组织损伤等副作用。

[0037](4)本发明通过对去甲斑蝥素导入外泌体方法的研究，通过对电穿孔电压、电击时间及次数的控制，成功将去甲斑蝥素的包封率提高到10％以上，最高可达20.17％，大大提高了其包封率，增强了去甲斑蝥素的载药量，提高其药物的有效性。

附图说明
[0038]图1为差速离心法提取外泌体流程图。

[0039]图2为外泌体的表征。

[0040](A)western blot检测外泌体表面标志蛋白；
[0041](B)透射电子显微镜检测空白外泌体(Blank‑exos)的形态；
[0042](C)载药外泌体(Exos‑NCTD)的TEM图像。

箭头表示典型的外泌体(标尺＝200nm)；
[0043](D)Blank‑exos的粒径图(平均粒径为112.5nm)；
[0044](E)Exos‑NCTD的粒径图(平均粒径为127nm)。

[0045]图3为NCTD和Exos‑NCTD的体外释放曲线。

[0046]曲线a:NCTD在1％SDS PBS中的释放率(pH＝7.4,37±1℃)；
[0047]曲线b:Exos‑NCTD在1％SDS PBS中的释放率(pH＝5.8,42±1℃)；
[0048]曲线c:Exos‑NCTD在1％SDS PBS中的释放率(pH＝7.4,37±1℃)。

[0049]图4A‑B:
[0050](A)CCK‑8法检测细胞增殖。

NCTD的IC50值为26.14，Exos‑N(C)CTD的IC50值为10.89。

[0051](B)给药后细胞形态学变化。

[0052]图4C:显微图；显微镜下观察细胞迁移(C1‑1、C1‑2)和细胞侵袭(C2‑1、C2‑2) [0053]图4D：细胞凋亡(1‑1、1‑2、1‑3、1‑4、2)；
[0054]1‑1：空白对照；1‑2：NCTD图；1‑3：Blank‑Exos图；1‑4：Exos‑NCTD图；
[0055]图4E：细胞周期(1‑1、1‑2、1‑3、1‑4、2)。

[0056]图5:HepG2细胞摄取。

(A)荧光显微镜观察细胞摄取情况。

(B)流式细胞术检测摄取率 (1‑7)。

[0057]图6：使用体内荧光成像系统评估BMSC‑Exos的体内归巢效应。

(A)活体动物成像(B)器官体外成像。

[0058]图7：BMSC‑Exos‑NCTD的体内抗肿瘤作用。

[0059](A)HepG2细胞悬液注射法在体内原位模型的建模过程；
[0060](B)实验结束时肝脏和肿瘤的体外成像；
[0061](C)治疗期间小鼠体重的变化；
[0062](D)实验结束时各组肿瘤重量的比较；
[0063](E)HepG2原位肿瘤切片的组织学特征；
[0064](F)实验结束时用H&E对小鼠的各种器官进行染色。

具体实施方式
[0065]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。

但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0066]以下实验中的NCTD为去甲斑蝥素，Exos‑NCTD为负载去甲斑蝥素的外泌体[0067]实施例1：一种负载去甲斑蝥素外泌体制备方法及其性质表征
[0068](1)外泌体的提取：
[0069]采用差速离心法提取外泌体。

将骨髓间充质干细胞(BMSCs)于培养皿里扩培，待细胞密度为80％时，弃掉原含有血清的培养液，用PBS洗2次后，加入DMEM，饥饿培养48h。

收集含有外泌体的DMEM，低温离心三次除去大分子物质，第一次离心，于4℃，300g，离心10min，吸取上清液，弃沉淀物，目的是除去细胞及死细胞等物质；第二次离心，于4℃， 2000g，离心15min，弃沉淀，取上清，此次离心的目的是除去较大的细胞碎片等物质；第三次离心，于4
℃，10000g，离心30min，取上清液，此次离心的目的除去较小的细胞碎片等物质。

将上步骤得到的上清液移至超速离心管中，进行两次离心提高外泌体纯度，第一次离心，于4℃，100000g，离心70min，取出超速离心管，弃上清液，取沉淀；第二次离心，于4℃，100000g，离心70min，弃上清液，取沉淀，加PBS重悬后，转移到离心管，得纯化外泌体，于‑80℃冰箱保存。

(见图1)
[0070]外泌体的鉴定：
[0071]对上述超速离心提取的物质进行鉴定。

首先采用western blot对外泌体表面标记蛋白CD9、CD81、ALIX、CD63和HSP70检测进行分析(见图2A)。

然后，通过透射电子显微镜(TEM) 对外泌体进行形态学评价(见图2B)，最后采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)对外泌体的粒径大小和外泌体浓度进行检测(见图2D、2E)。

[0072]图2是Blank‑Exos和Exos‑NCTD的性质表征。

通过western blotting分析，证实了经超速离心法纯化的物质表达了外泌体表面受体(CD9、CD81、ALIX、CD63和HSP70)(图2A)。

通过电镜形态分析和NTA分析可见，所提取的物质具有碟状球状的典型外泌体结构(图2B)，提取物粒径集中在73nm和151nm处，平均粒径为112.5nm(图2D)，综上所述，本实验提取的物质为外泌体。

经电穿孔载药后，外泌体形态与载药前无明显差异(图2C)，但粒径略大于原尺寸，从112.5nm增大到127nm(图2E)。

[0073](2)外泌体载药：
[0074]采用电穿孔法装载药物。

将含有去甲斑蝥素和上述外泌体的PBS放入电转杯中，其中外泌体与去甲斑蝥素的质量比为1:2，电穿孔采用0.56mv电压进行电刺激，每隔30s电击一次，共电击8次。

电刺激后，将混合溶液与37℃孵育30min，促使外泌体膜愈合。

通过TEM和 NTA对评价载药外泌体表征(见图2C)。

采用超滤法除去未包裹的游离药物，并用高效液相色谱法检测药物含量，计算包封率为12.17％。

即得基于骨髓间充质干细胞外泌体包裹的去甲斑蝥素制剂。

[0075]实施例2一种负载去甲斑蝥素外泌体制备方法及其性质表征
[0076](1)外泌体的提取：
[0077]采用超速离心法提取外泌体。

将骨髓间充质干细胞(BMSCs)于培养皿里扩培，待细胞密度为90％时，弃掉原含有血清的培养液，用PBS洗3次后，加入DMEM，饥饿培养45h。

收集含有外泌体的DMEM，低温离心三次除去大分子物质，第一次离心，于6℃，400g，离心5min，吸取上清液，弃沉淀物，目的是除去细胞及死细胞等物质；第二次离心，于6℃， 1000g，离心20min，弃沉淀，取上清，此次离心的目的是除去较大的细胞碎片等物质；第三次离心，于6℃，8000g，离心40min，取上清液，此次离心的目的除去较小的细胞碎片等物质。

将上步骤得到的上清液移至超速离心管中，进行两次离心提高外泌体纯度，第一次离心，于2℃，80000g，离心80min，取出超速离心管，弃上清液，取沉淀；第二次离心，于 2℃，120000g，离心60min，弃上清液，取沉淀，加PBS重悬后，转移到离心管，于‑80℃冰箱保存。

[0078]外泌体的鉴定：
[0079]对上述超速离心提取的物质进行鉴定。

首先采用western blot对外泌体表面标记蛋白 CD9、CD81、ALIX、CD63和HSP70检测进行分析。

然后，通过透射电子显微镜(TEM)对外泌体进行形态学评价，最后采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)对外泌体的粒径大小和外泌体浓度进行检测。

[0080](2)外泌体载药：
[0081]采用电穿孔法装载药物。

将含有去甲斑蝥素和上述外泌体的PBS放入电转杯中，其中外泌体与去甲斑蝥素的质量比为1:0.5，电穿孔采用0.5mv电压进行电刺激，每隔25s电击一次，共电击10次。

电刺激后，将混合溶液于35℃孵育35min，促使外泌体膜愈合。

通过TEM和 NTA评价载药外泌体表征。

采用超滤法除去未包裹的游离药物，并用高效液相色谱法检测药物含量，计算包封率为15.68％。

即得基于骨髓间充质干细胞外泌体包裹的去甲斑蝥素制剂。

[0082]实施例3一种负载去甲斑蝥素外泌体制备方法及其性质表征
[0083](1)外泌体的提取：
[0084]采用超速离心法提取外泌体。

将骨髓间充质干细胞(BMSCs)于培养皿里扩培，待细胞密度为80％时，弃掉原含有血清的培养液，用PBS洗3次后，加入DMEM，饥饿培养50h。

收集含有外泌体的DMEM，低温离心三次除去大分子物质，第一次离心，于2℃，200g，离心20min，吸取上清液，弃沉淀物，目的是除去细胞及死细胞等物质；第二次离心，于2℃， 3000g，离心10min，弃沉淀，取上清，此次离心的目的是除去较大的细胞碎片等物质；第三次离心，于2℃，12000g，离心10min，取上清液，此次离心的目的除去较小的细胞碎片等物质。

将上步骤得到的上清液移至超速离心管中，进行两次离心提高外泌体纯度，第一次离心，于6℃，80000g，离心80min，取出超速离心管，弃上清液，取沉淀；第二次离心，于6℃，80000g，离心80min，弃上清液，取沉淀，加PBS重悬后，转移到离心管，于‑80℃冰箱保存。

[0085]外泌体的鉴定：
[0086]对上述超速离心提取的物质进行鉴定。

首先采用western blot对外泌体表面标记蛋白 CD9、CD81、ALIX、CD63和HSP70检测进行分析。

然后，通过透射电子显微镜(TEM)对外泌体进行形态学评价，最后采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)对外泌体的粒径大小和外泌体浓度进行检测。

[0087](2)外泌体载药：
[0088]采用电穿孔法装载药物。

将含有去甲斑蝥素和上述外泌体的PBS放入电转杯中，其中外泌体与去甲斑蝥素的质量比为1:1，电穿孔采用0.7mv电压进行电刺激，每隔30s电击一次，共电击6次。

电刺激后，将混合溶液于38℃孵育25min，促使外泌体膜愈合。

通过TEM和 NTA评价载药外泌体表征。

采用超滤法除去未包裹的游离药物，并用高效液相色谱法检测药物含量，计算包封率为20.17％。

即得基于骨髓间充质干细胞外泌体包裹的去甲斑蝥素制剂。

[0089]实施例1‑1
[0090]将实施例1步骤(2)外泌体载药中的电穿孔电压调整为2.0mv，其余与实施例1保持一致，包封率为4.19％。

[0091]实施例1‑2
[0092]与实施例1的区别是，步骤(2)中电穿孔操作每隔20s电击一次，电击4次，其余与实施例1保持一致，包封率为3.89％。

[0093]实施例1‑3
[0094]与实施例1的区别是外泌体与去甲斑蝥素的质量比为1:0.3；其余与实施例1保持一致。

最终包封率为7.15％。

[0095]实施例1‑4
[0096]与实施例1的区别是外泌体与去甲斑蝥素的质量比为1:4；其余与实施例1保持一致。

最终包封率为5.54％。

[0097]本发明通过对去甲斑蝥素导入外泌体方法的研究，通过对电穿孔电压、电击时间及次数的控制，成功将去甲斑蝥素的包封率提高到10％以上，最高可达20.17％，大大提高了其包封率，增强了去甲斑蝥素的载药量，提高其药物的有效性。

[0098]调整电穿孔电压，过大时导致外泌体的双层膜出现了不可修复的孔洞，导致药物装载后会泄露，包封率低；实施例1‑2电穿孔电击条件不在本发明研究范围内，未能达到使外泌体的双层膜出现的“瞬时孔洞”，导致药物难以装载，包封率低；实施例1‑3由于外泌体与去甲斑蝥素的质量比过高，药物浓度过低，药物难以寻找外泌体的瞬时孔洞，药物难以装载，包封率低；而质量比过低，药物浓度过高，外泌体包裹药物的通道有限，药物进入外泌体存在竞争性，导致药物难以装载，包封率低。

[0099]效果例1：一种基于骨髓间充质干细胞外泌体包裹去甲斑蝥素治疗肝癌制剂的体外释药行为考察
[0100]透析袋(10‑15cm，口径25mm，分子截留量＝3500)先用50％乙醇煮沸15min以除去对蛋白质和其他生物活性物质有害的杂质，后用蒸馏水煮沸两次彻底清洗透析袋，每次10min，放冷后用75％乙醇浸泡，在4℃环境下放置过夜。

使用前再取出用蒸馏水煮沸两次，每次 10min，将透析袋内外清洗干净。

[0101]分别在上述透析袋装入2ml去甲斑蝥素(NCTD)和去甲斑蝥素外泌体(Exos‑NCTD)，扎紧透析袋，放入装有20ml pH为7.4的含有1％SDS的PBS释放介质的50ml离心管中，将离心管放入空气摇床中恒温37±1℃，以100rpm振摇，模拟体内环境。

另取已预处理的透析袋装入2ml Exos‑NCTD扎紧，放入装有20ml pH为5.8的含有1％SDS的PBS释放介质的50ml 离心管中，将离心管放入空气摇床中恒温42±1℃，以100rpm振摇，模拟肿瘤细胞环境。

分别在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h，取2ml释放介质并补充同等体积释放介质。

取出的释放介质经0.45nm滤膜过滤后置于液相小瓶中，使用高效液相色谱仪测定并计算累积释放度：
[0102]
[0103]累积释放度，Cn‑‑第n个取样点的释放介质浓度，Ci‑‑第i个取样点的释放介质浓度，V‑‑ 离心管中释放介质总体积，Vi‑‑第i个取样点的释放介质取样体积，M‑‑药物总质量[0104]释药曲线拟合及结果分析
[0105]体外释放度是预测药物给药后体内动力学的重要参数，为今后的研究奠定基础。

[0106]图3是NCTD和Exos‑NCTD随时间的累积释放速率。

正常情况下，游离NCTD的累积释放度在10h时达到93.02％(曲线a)，而Exos‑NCTD在12h是缓慢释放，36h的累积释放度为 79.84％(曲线b)，这表明经过外泌体装载的药物具有一定的缓释性。

[0107]对比图3(曲线c)和(曲线b)可以看出，在微酸性高温模拟肿瘤条件下，Exos‑NCTD 在48h 的累积释放量从72.14％增加到80.78％。

这可能是由于外泌体摄取微环境也呈酸性， BMSC‑Exos在酸性介质中降解较多，从而导致药物快速释放，促进了微酸性环境下药物。