课件1：1.2 基因工程的基本操作程序
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限制酶
许多DNA片段 与运载体连接 导入
受体菌群体
某种生物某个时期的mRNA 反转录
cDNA
与运载体连接 导入 受体菌群体
(一)、目的基因主要是____编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因 请举出三个以上的例子
（二）、获取目的合成一、目的基因的获取 （一）从基因中直接获取 1.基因：概念见P9
2.基因的分类:按外源DNA片段的来源分类
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
有了目的基因，我们 才能赋予一种生物以 另一种生物的遗传特 性使。目的基因在受体细 胞中稳定存在，并可 进行遗传、表达和发 挥作用 载体进入受体细胞稳 定表达，才能实现一 种生物的基因在另一 种生物中的转化。
才能确定目的基因是 否真正在受体细胞中 稳定遗传和正确表达。
一、目的基因的获取 请阅读P9第一和二两段
形成整个DNA分子
（三）人工合成的目的基因
1）反转录法：
以目的基因转录成的 信使RNA为模板，反转录成 互补的单链DNA，然后在酶 的作用下合成双链DNA，从 而获得所需的基因。
目的基因的mRNA 反转录
单链DNA (cDNA） 合成
双链DNA (即目的基因)
2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植 物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细 胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过程： ④优点
（2）基因枪法 （3）花粉管通道法
2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序：
目的基因表达载体提纯 显微注射 新性状动物
检测— (分子 水平)
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交（注意与上不同之处）
③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 （个体水平）
归纳: 基因工程的基本操作程序
人教版选修3
专题1 基因工程 课题2 基因工程的基本操作程序
基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设 计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的 遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物 产品。（既是概念，又是原理）
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
三、将目的基因导入受体细胞 （一）转化：目 细的 胞基 内因维进持入_稳___定__受___和体___表细____达胞__内_的，过并程且在 受体
（二） 方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入
动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——感受态细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法
③ 条件：已__知__基__因__的__核__苷_酸__序__列__（__前__提__）、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸_ 、 __一__对__引__物___ 、 _耐__热__的__D_N_A_聚__合__酶__（__T_a_q_酶__）
④ 方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循环的 次数）
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起 始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能 阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来， 使转录终止。 RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合 的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
原核 细胞
的 基因 结构
编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。
非编码区
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。
知识点一：2、真核细胞的基因结构
用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限 制性内切酶作用于图中的 a 处，DNA连接酶 作用于 a 处。（填“a”或“b”）
练习1：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲
等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因
培育出了耐盐水稻新品系。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆
取卵（受精卵） 受精卵
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法：
用Ca2+处理细胞
感受态细胞
达载体与感受态细胞混合
吸收DNA分子
表 感受态细胞
四、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
（一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤)
蛋白质 mRNA的
结构基因
的氨基 推测 核苷酸 推测 的核苷酸 化学
酸序列
序列
序列 合成
目的 基因
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 表达和发挥作用。
2、表达载体的组成 1）启动子 2）终止子 3）目的基因 4）标记基因等
非编码区 编码区上游
编码区
启动子 与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
非编码区 编码区下游
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
真核 细胞
的 基因 结构
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。
(二)利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相 原理 同 原料 点 条件
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
解旋 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 不 方式
同 场所
体外复制
点
酶 热稳定的DNA聚合酶
细胞核内 细胞内的DNA聚合酶
结果 大量的DNA片段
3、过程: 质粒
DNA分子
同一种 限制酶处理
二个切口 两个黏性末端
四个切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒）
注意
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制 原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了 目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到 DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化 学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体 的方式携带进去。
⑤ 结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥ 过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与 DNA模板结合，形成局部___双__链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物处延伸，合成与模板互补 的__D_N_A_链___。
非编码序列： 包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的、 不_连__续__的
都由能够编码蛋白质的_编__码__区_和具有调控
相同点
作用的_非__编__码_区组成的
思考：
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞 基因结构一样长吗？
菌转化法和
基因枪法（花粉管通道法）
法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用
技术，该技术的核心是 植物组织培养
和
脱分化和再分化 。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放
射性同位素标记的 耐盐基因 作探针进行分子杂交检测，
又要用 一定浓度盐水浇灌
方法从个体水平鉴
定水稻植株的耐盐性。
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
步骤是
（ C）
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
知识点一：1.原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
பைடு நூலகம்
练习
1）以下说法正确的是（ C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制 酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 （ D）
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA
（1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: ① 首先取出转基因生物的基因组DNA
② 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以 此做探针
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明染色体已插入染色体DNA中
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单 链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列， 那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双 链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离 的单链。
P15思考与探究
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法:
分子杂交
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出
现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交 （二）、鉴定（个体生物学水平）
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
归纳步骤
(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是. 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：
练习1：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三
角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应基因组部分基因 （cDNA）
5.基因组和部分基因组(cDNA)比较(二)利用PCR技术扩增目的基因
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
② 原理：__D_N_A_复__制___
它们各自的作用是什么?
启动子：位于基因的首端的一 段特殊的DNA片断，它是RNA聚 合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动基因转录出mRNA， 最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一 段特殊的DNA片断，能终止 mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的 基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
许多DNA片段 与运载体连接 导入
受体菌群体
某种生物某个时期的mRNA 反转录
cDNA
与运载体连接 导入 受体菌群体
(一)、目的基因主要是____编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因 请举出三个以上的例子
（二）、获取目的合成一、目的基因的获取 （一）从基因中直接获取 1.基因：概念见P9
2.基因的分类:按外源DNA片段的来源分类
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
有了目的基因，我们 才能赋予一种生物以 另一种生物的遗传特 性使。目的基因在受体细 胞中稳定存在，并可 进行遗传、表达和发 挥作用 载体进入受体细胞稳 定表达，才能实现一 种生物的基因在另一 种生物中的转化。
才能确定目的基因是 否真正在受体细胞中 稳定遗传和正确表达。
一、目的基因的获取 请阅读P9第一和二两段
形成整个DNA分子
（三）人工合成的目的基因
1）反转录法：
以目的基因转录成的 信使RNA为模板，反转录成 互补的单链DNA，然后在酶 的作用下合成双链DNA，从 而获得所需的基因。
目的基因的mRNA 反转录
单链DNA (cDNA） 合成
双链DNA (即目的基因)
2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植 物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细 胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过程： ④优点
（2）基因枪法 （3）花粉管通道法
2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序：
目的基因表达载体提纯 显微注射 新性状动物
检测— (分子 水平)
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交（注意与上不同之处）
③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 （个体水平）
归纳: 基因工程的基本操作程序
人教版选修3
专题1 基因工程 课题2 基因工程的基本操作程序
基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设 计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的 遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物 产品。（既是概念，又是原理）
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
三、将目的基因导入受体细胞 （一）转化：目 细的 胞基 内因维进持入_稳___定__受___和体___表细____达胞__内_的，过并程且在 受体
（二） 方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入
动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——感受态细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法
③ 条件：已__知__基__因__的__核__苷_酸__序__列__（__前__提__）、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸_ 、 __一__对__引__物___ 、 _耐__热__的__D_N_A_聚__合__酶__（__T_a_q_酶__）
④ 方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循环的 次数）
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起 始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能 阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来， 使转录终止。 RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合 的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
原核 细胞
的 基因 结构
编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。
非编码区
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。
知识点一：2、真核细胞的基因结构
用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限 制性内切酶作用于图中的 a 处，DNA连接酶 作用于 a 处。（填“a”或“b”）
练习1：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲
等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因
培育出了耐盐水稻新品系。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆
取卵（受精卵） 受精卵
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法：
用Ca2+处理细胞
感受态细胞
达载体与感受态细胞混合
吸收DNA分子
表 感受态细胞
四、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
（一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤)
蛋白质 mRNA的
结构基因
的氨基 推测 核苷酸 推测 的核苷酸 化学
酸序列
序列
序列 合成
目的 基因
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 表达和发挥作用。
2、表达载体的组成 1）启动子 2）终止子 3）目的基因 4）标记基因等
非编码区 编码区上游
编码区
启动子 与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
非编码区 编码区下游
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
真核 细胞
的 基因 结构
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。
(二)利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相 原理 同 原料 点 条件
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
解旋 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 不 方式
同 场所
体外复制
点
酶 热稳定的DNA聚合酶
细胞核内 细胞内的DNA聚合酶
结果 大量的DNA片段
3、过程: 质粒
DNA分子
同一种 限制酶处理
二个切口 两个黏性末端
四个切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒）
注意
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制 原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了 目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到 DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化 学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体 的方式携带进去。
⑤ 结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥ 过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与 DNA模板结合，形成局部___双__链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物处延伸，合成与模板互补 的__D_N_A_链___。
非编码序列： 包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的、 不_连__续__的
都由能够编码蛋白质的_编__码__区_和具有调控
相同点
作用的_非__编__码_区组成的
思考：
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞 基因结构一样长吗？
菌转化法和
基因枪法（花粉管通道法）
法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用
技术，该技术的核心是 植物组织培养
和
脱分化和再分化 。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放
射性同位素标记的 耐盐基因 作探针进行分子杂交检测，
又要用 一定浓度盐水浇灌
方法从个体水平鉴
定水稻植株的耐盐性。
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
步骤是
（ C）
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
知识点一：1.原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
பைடு நூலகம்
练习
1）以下说法正确的是（ C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制 酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 （ D）
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA
（1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: ① 首先取出转基因生物的基因组DNA
② 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以 此做探针
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明染色体已插入染色体DNA中
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单 链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列， 那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双 链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离 的单链。
P15思考与探究
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法:
分子杂交
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出
现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交 （二）、鉴定（个体生物学水平）
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
归纳步骤
(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是. 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：
练习1：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三
角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应基因组部分基因 （cDNA）
5.基因组和部分基因组(cDNA)比较(二)利用PCR技术扩增目的基因
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
② 原理：__D_N_A_复__制___
它们各自的作用是什么?
启动子：位于基因的首端的一 段特殊的DNA片断，它是RNA聚 合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动基因转录出mRNA， 最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一 段特殊的DNA片断，能终止 mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的 基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。