小鼠生长迟缓模型的建立及指标评价

小鼠生长迟缓模型的建立及指标评价
朱玉欣;马维超;范永超;冯波;张倩;董虹;穆祥
【摘要】试验旨在通过灌服细菌上清、破碎液建立小鼠生长迟缓模型,为开发具有促生长作用的饲料添加剂提供动物模型.培养大肠杆菌K99,离心收集培养上清,取部分细菌悬液进行超声破碎;试验小鼠随机分为4组(对照组、上清组、破碎组、悬液组),对照组灌服0.2 mL生理盐水,另外3组分别灌服等体积细菌培养上清、破碎液及悬液,每日1次,连续灌服15d;观察小鼠精神状态,记录小鼠体重,测定各脏器指数,采用ELISA方法检测各组小鼠血清IL-6和TNF-α的水平.与空白组相比,其余3组小鼠日增重及脾脏指数均显著降低;肺脏指数显著升高;肝脏、胸腺指数及血清IL-6和TNF-α的水平无显著变化.通过灌服大肠杆菌K99培养上清、破碎液及悬液成功建立了小鼠生长迟缓模型,能够为开发具有细菌毒素灭活作用的中药添加剂提供动物模型.
【期刊名称】《中国兽医杂志》
【年(卷),期】2018(054)003
【总页数】5页(P80-84)
【关键词】大肠杆菌K99;细菌毒素;小鼠;生长迟缓模型;指标评价
【作者】朱玉欣;马维超;范永超;冯波;张倩;董虹;穆祥
【作者单位】北京农学院动物科技学院北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中
国农业大学动物医学院,北京海淀100193;北京农学院动物科技学院北京农学院兽
医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206
【正文语种】中文
【中图分类】Q95-331
抗生素作为饲料添加剂具有促进机体生长的作用,但长期、大量地使用抗生素会给
动物源性食品安全带来诸多问题,因此世界各国开始限制或禁止抗生素在饲料中的
使用,并开始研发新型促生长饲料添加剂来逐步替代抗生素。

目前,关于饲料添加用
抗生素促生长的机理尚不完全清楚。

通过查阅文献及本团队前期研究,我们认为抗
生素促生长的机制可能是抑制了饲料在储藏过程中细菌的增殖,进而减少细菌毒素
的释放。

反之,饲喂含有大量细菌或毒素的饲料会导致动物生长迟缓。

因此,本研究
尝试通过灌服细菌悬液及细菌毒素的方式建立小鼠生长迟缓模型,期望能够为研发
具有细菌毒素灭活作用的中药饲料添加剂提供动物模型。

1 材料
1.1 试验菌株及试验材料大肠杆菌K99来自北京农学院,兽医学(中医药)北京市重点实验室保藏;Yeast Extract、Tryptone,均购自 OXOID 公司,批号分别为LP0021、LP0042;NaCl,购自VETEC公司,批号V900058-500G;麦康凯培养基,购自北京奥博星生物技术有限责任公司,批号02-005A;小鼠IL-6试剂盒及TNF-α试剂盒,均购自美国R&D公司;SPF级BALB/c雄性小鼠,体重10-12 g,80只,购自北京维通利华
实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]。

1.2 试验仪器生物安全柜(Thermo公司);电子天平(上海天平仪器厂);涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);精密pH计(SANYO公司);显微镜(OLYMPUS
公司);细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);多功能酶标仪(美国BIOTEK公司);全温振荡培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

2 方法
2.1 大肠杆菌的培养及破碎将冻存的大肠杆菌K99室温融化后接种到5 mL LB 培养基中,37℃,220 r/min,培养24 h。

将100 μL此菌液接种到5 mL LB培养基中,培养18 h,划线接种到麦康凯平板培养基上培养18 h,挑取状态良好的单菌落接种到LB培养基中,进行增菌镜检。

取纯化后的菌液100 μL接种到5 mL LB培养基中,共接18管,37℃,220 r/min,分别在 16、18、20、22、24 h 取 3 管,测定生长曲线。

根据生长曲线选择细菌破碎时间。

将大肠杆菌菌体悬液放入50 mL小烧杯中,超声破碎仪进行破碎,每间隔5 s破碎5 s;每5 min检测一次菌体破碎液的
OD600nm值(600 nm),破碎10 min后,取少量液体进行革兰染色镜检,观察细菌状态。

2.2 动物分组将80只SPF级BALB/c雄性小鼠分为4组,每组20只。

空白组、上清组、破碎组、悬液组分别给予生理盐水、细菌上清、破碎液及细菌悬液,0.2 mL/只,连续灌胃 15 d。

2.3 小鼠生长性能分别在第1天和第15天称量体重及采食量,计算各组平均日增重、平均日采食量。

2.4 炎性因子的测定对称量完体重的各组小鼠进行眼球采血,室温静置1 h,3 000 r/min离心15 min后收集血清,使用ELISA试剂盒测定IL-6、TNF-α的水平。

2.5 脏器指数的测定脱颈处死采血后的各组小鼠,采集肺脏、肝脏、脾脏并称重,计算脏器指数。

计算公式为:脏器指数=脏器重量(ɡ)/活体重(ɡ)。

2.6 统计分析使用SPASS 17.0统计软件进行数据处理,采用独立样本t检验,试验数据均以平均值±标准差表示,P≤0.05为差异显著,P≤0.01为差异极显著。

3 结果
3.1 大肠杆菌K99生长曲线如图1所示,在培养到16～20 h细菌达到平台期,在22 h时活菌数达到最大,之后随着时间的延长活菌数下降。

图1 细菌生长曲线
3.2 细菌破碎时间的筛选在10 min之内,随着破碎时间的延长,细菌悬液吸光度不断下降,10 min后,吸光度不再改变(图2)。

取破碎10 min的菌液镜检,细菌失去正常的形态,活性丧失(图3)。

图2 细菌破碎
图3 破碎10 min后的细菌(100×)
3.3 小鼠生长性能与空白组相比,细菌上清组、日增重显著下降(P＜0.05),破碎组日增重极显著下降(P＜0.01),如图4所示。

细菌上清组、破碎组及悬液组日采食量与空白组相比均有所下降,但统计学上无显著性差异(P＞0.05)(图5)。

3.4 脏器指数的测定与空白组相比,细菌上清组、破碎组、悬液组肺脏指数极显著升高(P＜0.01),脾脏指数极显著下降 (P＜0.01),肝脏、胸腺指数无显著变化(P＞0.05)(图6)。

图4 小鼠日增重注:∗:P＜0.05;∗∗:P＜0.01
图5 小鼠日采食量
图6 脏器指数注:∗:P＜0.05;∗∗:P＜0.01; ∗∗∗:P＜0.01
3.5 IL-6及TNF-α的水平空白、上清、破碎、悬液4组中,大部分小鼠血清中IL-6均在0～20 pg/mL之间,而破碎和悬液两组中极少数的小鼠血清中IL-6含量在20 pg/mL以上,但均无显著差异(P＞0.05)(图7)。

上清、破碎、悬液3组中小鼠血清中TNF-α较稳定,与空白组比均无差异(P＞0.05),无统计学意义(图8)。

图7 小鼠血清IL-6水平
图8 小鼠血清TNF-α水平
4 讨论与结论
在感染过程中,为对抗机体的免疫系统,细菌会在不同的时期表达不同的毒力因子,在这些毒力因子中发挥主要作用的就是细菌毒素[1],包括外毒素和内毒素。

外毒素是大部分病原菌在代谢过程中分泌到菌体外的蛋白质,细菌产生的外毒素对组织的毒性作用有高度的选择性,各自引起特殊的临床症状。

内毒素是革兰阴性细菌细胞壁的组成成分,其主要化学成分为脂多糖[2],不同病原菌所产生的内毒素引起的症状大致相同,都能引起机体体温升高、腹泻和出现出血性休克和其他症状[3-5]。

但利用毒素建立生长迟缓模型的研究鲜有报道,因此,本试验研究尝试采用灌服细菌培养上清液及破碎液的方法来建立小鼠生长迟缓模型。

细菌外毒素在生长繁殖的过程中分泌到菌体外,但也有少数则存在菌体内,当细菌裂解后释放到菌体外。

内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌体后才释放出来。

因此,只有破碎细菌才能获得高浓度的细菌毒素。

通过对K99生长曲线的测定可知,16～20 h是该菌生长的平台期,22 h时活菌数达到最大,此时,细菌毒素产生的速率最大,24 h时,活菌数显著下降,其可说明在24 h时产生的毒素是最多的,因此选择此时进行细菌破碎可获得最大的毒素浓度。

张帅[6]报道采用微波法、珠磨法、超声波法、反复冻融法、石英砂研磨法分别对嗜酸乳杆菌进行细胞破碎分离细菌毒素,结果表明超声波破碎法细胞破碎效果最好。

本试验采取超声破碎的方法进行细菌破碎,随着超声时间的延长,探头温度上升,易破坏细菌外毒素,因此我们选择工作5 s,间隔5 s,而且将菌液放入冰上以维持低温。

随着破碎时间的延长,OD值成依赖性下降,破碎10 min时,OD值达到最低,取菌液进行革兰染色,菌体失去原有的形态,说明细菌已完全破碎。

尽管细菌的外毒素和内毒素在结构性质和作用机制上完全不同,但都能不同程度地对机体产生严重损害。

体重是衡量小鼠生长发育的一项重要指标。

本试验研究结果显示,细菌上清组日增重与空白组相比显著下降;破碎组、悬液组日增重与空白组相
比极显著下降,其说明细菌毒素能够使小鼠生长迟缓,模型建立成功。

动物的脏器指
数是重要的生物学特性指标之一,其数值大小可以在一定程度上反映机体的功能状态。

前期有报道[7]表明,口服呕吐毒素组和各联合毒素组小鼠增重显著低于对照组(P＜0.05);呕吐毒素组、烟曲霉素B1组和各联合毒素组小鼠脾脏和胸腺指数显著
低于对照组(P＜0.05)。

细菌毒素可能会通过影响机体器官功能状态,进而造成动物
的生长迟缓。

本试验结果发现,细菌上清组、破碎组、悬液组对脾脏指数的影响差
异均显著。

内毒素可以激活在上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞上的Toll样受体4,然后通过
骨髓分化初级反应基因88(MyD88)依赖途径激活NF-κB,释放IL-6、TNF-α等炎
症细胞因子[8]。

IL-6可通过诱导纤维蛋白原启动凝血因子,在肠道黏膜异常堆积,使炎症反应不断加重[9]。

TNF-α可在受损的肠黏膜中大量表达,并且其病变范围越大、病变越严重,TNF-α水平越高[10]。

我们猜测,口服细菌毒素会导致肠黏膜发生炎症反应,进而影响生长性能。

因此,我们通过检测IL-6、TNF-α的水平来验证口服细菌毒素是否会造成小鼠炎症反应。

结果表明,通过灌服细菌毒素的方式对大部分小鼠
不会引起炎性反应。

此外,Dutch Committee on Occupational Standards证实:
口服LPS对健康的人群只会造成微弱的伤害[11]。

因此,我们推测造成小鼠生长迟
缓的原因并不是毒素进入机体引起炎症反应造成的。

本研究中极少数小鼠血清IL-
6水平升高可能是个体肠道机能减退造成的。

近半个世纪以来,抗生素作为抗菌助长剂添加到饲料中,对控制畜禽疾病的发生,促进畜禽生长发育,提高饲养效益确实起到积极的作用。

目前,抗生素促生长的机理尚不
明确。

传统的观点认为抗生素的各种作用效果都是基于抗生素对肠道微生物的直接作用。

Niewold则认为抗生素具有促生长的作用可能是其抑制动物肠道的炎症反
应[12]。

我们认为饲料在储存过程中,易滋生细菌,产生大量的细菌毒素,其是引起动物生长迟缓的主要原因,饲用抗生素主要通过抑制有害病原微生物的增殖及活性,进
而减少毒素的释放量,起到促动物生长的效果。

本试验中细菌破碎液和细菌悬液均能极显著降低小鼠体重,说明细菌可通过产生毒素抑制动物生长。

但是,长期、大量地使用抗生素可能会使病原菌产生耐药性[13]等多种副作用。

因此,世界各国陆续开始限制或禁止将抗生素添加在饲料里[14]。

中药具有天然性、毒副作用小、无残留和无耐药性等独特优势[15-16],可作为抗菌和促生长的饲料添加剂,具有广阔的开发前景。

目前,在代替抗生素的中药饲料添加剂开发研究领域,尚缺乏统一的动物模型。

本研究中建立的小鼠生长迟缓模型,可为该领域提供稳定可靠的实验动物模型,促进中药添加剂的研究发展,也可为相关模型建立与发展提供一定的参考。

本研究通过灌服细菌毒素成功建立了小鼠生长迟缓模型,为研究替代抗生素饲料添加剂提供了动物模型,但是本研究还存在很多不足。

本试验采用大肠杆菌K99上清及破碎均是小鼠日增重显著下降,但是其产生的毒素种类复杂,尚不清楚是那一种毒素还是几种毒素联合导致小鼠生长迟缓,还需进一步研究。

灌服毒素抑制生长的机制还不清楚,其机理还需深入研究,通过本试验初步确定与炎性因子IL-6、TNF-α水平升高无关。

本研究表明,成功建立了灌服细菌毒素导致小鼠生长迟缓的模型,可为开发具有灭活细菌毒素的中药添加剂提供动物模型。

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