生物中图版学案：第六章第二节DNA片段的扩增——PCR技术

第二节DNA片段的扩增——PCR技术
1．理解PCR扩增DNA片段的原理。

2．尝试PCR技术的基本操作和应用。

一、细胞内的DNA复制
过程：首先在解旋酶的作用下解开DNA双链;接着在RNA聚合酶的作用下,以DNA单链为模板，合成一段RNA引物（两条DNA 模板链各需一个RNA引物）；然后以RNA引物为起点，在DNA聚合酶的作用下,以四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成两条新的DNA子链.
二、DNA体外扩增—-PCR技术
1．概念：DNA体外扩增技术实际上是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，形成大量特异性的DNA片段,这个反应过程称为聚合酶链式反应,简称PCR。

2．PCR过程与细胞内的DNA复制过程的区别
（1）PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20～30个脱氧核苷酸.
（2）PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。

3．PCR技术的操作
进行PCR过程前，将PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到一种特制的微量离心管中。

①高温变性:把离心管置于95 ℃的高温中，DNA碱
基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成两条单链。

②低温复性：将离心管置于55 ℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。

③中温延伸：再将离心管转置于72 ℃的环境中，在DNA聚合酶的催化作用下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个接一个地连接上去，从而形成了两条新的子链.于是，一个DNA分子便复制成了两个。

而新合成的DNA又可再度作为模板进行上述的循环,重复这三步操作，DNA片段便呈2的指数增长。

该过程可在DNA扩增仪（PCR仪）内进行.
4．PCR技术的优点
快速、高效、灵活和易于操作是PCR技术的突出优点。

5．PCR扩增效果的检测
可用分光光度法进行检测。

DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。

可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。

以蒸馏水作为空白对照,在波长260 nm处测PCR产物稀释液的光吸收值（用A260 nm表示）。

据测定，1 μg·mL－1的DNA在厚度为1 cm 比色杯中的吸光值为0。

02。

以此为标准，可以计算出样品中的DNA 浓度。

公式如下：
DNA的浓度（μg·mL－1）＝错误!×稀释倍数
思考：2003年SARS病毒席卷我国，随后生物科学研究所迅速研制出了SARS病毒基因诊断盒，使得能够快速诊断出非典患者，那么SARS病毒基因诊断盒所需的大量SARS基因是怎样获得的呢？
提示:采用PCR技术对SARS的基因迅速扩增产生的。

1．PCR技术与DNA的复制
PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

PCR 反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同.例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数.一个DNA片段在30
次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（230）。

2．你了解生物体内DNA的复制与PCR反应的异同吗？
可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限制在两个引物链5′端之间，是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板，引物是从3′端开始延伸，其5′端是固定的,3′端则没有固定的止点,长短不一，这就是“长产物片段”。

进入第二周期后，引物除与
原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”)结合.引物在与新链结合时，由于新链模板的5′端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3′端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内,形成长短一致的“短产物片段"。

不难看出“短产物片段"是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯的DNA片段供分析与检测用。

细胞内RNA和蛋白质的合成是从头开始的。

4．PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性（检测非目的片段的扩增，而未检测出目的片段的扩增）或假阴性（未检测出任何片段的扩增）的结果.
出现假阴性结果的常见原因有:TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制;引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够等等。

当实验中出现假阴性的情况时,应首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循环。

为了防止假阴性结果的出现，在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶.同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。

尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。

PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况,尤其需要保证引物的3′端与靶基因互补。

PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。

此外,样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果.为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到:
隔离操作区，分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头等。

题型一PCR的原理及应用
【例题1】下列有关PCR的描述不正确的是（）。

A．是一种酶促反应
B．引物决定了扩增的特异性
C．扩增产量为y＝(1＋x）n
D．扩增对象是氨基酸序列
解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物作用下使DNA 聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，短时间迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝(1＋x）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。

答案：D
【例题2】标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是（）。

A．95 ℃、55 ℃、72 ℃ B．72 ℃、55 ℃、95 ℃
C．55 ℃、95 ℃、72 ℃ D．80 ℃、55 ℃、72 ℃
解析:当温度在95 ℃时，双链DNA解聚为单链,称之为高温变性；当温度下降到55 ℃时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合称为低温复性；当温度上升到72 ℃时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G）在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,称为延伸.
答案：A
反思领悟:反思领悟：PCR的反应过程中每次循环可以分为变性、复性和延伸三步.
题型二PCR基本操作与产物测定
【例题3】在PCR实验操作中，下列说法不正确的是（)。

A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头
B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D．离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后,移液器上的枪头必须更换，确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10 s 的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果。

答案:A
1 DNA的复制需要引物，其主要原因是（)。

A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
解析：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（—OH）末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。

DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链。

因此，DNA复制需要引物.当引物与DNA 母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

答案：D
2 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸,是一小段( ）。

A．DNA B．RNA
C．DNA或RNA D．双链DNA
解析：用于PCR的引物是一小段DNA（单链）或RNA。

细胞内DNA的引物，一般为RNA。

答案：C
3 使用PCR仪的具体实验操作顺序应为( ）。

①设计好PCR仪的循环程序②按配方准备好各组分③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心使反应液集中在离心管底部
A．②③⑤④① B．①⑤③④②
C．②③⑤①④ D．④②⑤③①
解析:使用PCR仪进行DNA扩增前,首先按照PCR体系配方各组分，依次将各组分加入微量离心管离心，使反应液集中于试管底部,然后再设计好PCR仪的循环程序进行PCR反应。

答案：C
4 PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（).
A．反复洗涤B．外源DNA 污染
C．高压灭菌D．在－20 ℃储存
解析:通过对PCR实验中所用仪器和试剂进行高压灭菌，可以避免外源DNA等因素的污染。

答案：C。