胡桃楸成花相关基因JmSOC1_克隆和表达分析

张丽杰，董天一，吴静雯，等.胡桃楸成花相关基因JmSOC1克隆和表达分析[J].沈阳农业大学学报，2023，54（6）：673-682.
沈阳农业大学学报，2023，54(6)：673-682
Journal of Shenyang Agricultural University
http ：//
DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2023.06.004
收稿日期：2023-10-10
基金项目：辽宁省科技厅应用基础研究计划项目(2022JH2/101300170)第一作者：张丽杰（1972-），女，博士，教授，博士生导师，从事珍贵树种遗传改良和林业生物技术研究，E-mail :***************.cn
胡桃楸成花相关基因JmSOC1克隆和表达分析
张丽杰，董天一，吴静雯，张萌萌，贾若雪，刘春平
（沈阳农业大学林学院/辽宁省林木遗传育种与栽培重点实验室，沈阳110161）
摘
要：SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）在拟南芥中被证实为调节花芽发育的关键因子。

胡桃楸
是一种重要的木本油料果材兼用树种，其雌雄异型异熟的开花特性未知。

为探索SOC1基因在胡桃楸雌雄异型花芽发育过程的调控作用及促进早花的分子机制，利用胡桃楸花芽转录组数据获取SOC1基因CDS 序列，通过PCR 扩增技术克隆出SOC1基因的cDNA 序列全长，并对其进行生物学信息分析；同时，利用qRT-PCR 方法对SOC1基因在胡桃楸不同器官组织以及雌雄先型雌雄花芽不同发育时期的表达情况进行定量分析。

结果表明：胡桃楸成花相关JmSOC1基因cDNA 序列全长为705bp ，编码234个氨基酸；生物信息学分析得出JmSOC1蛋白分子量为21569.04Da ；理论等电点（pI ）值为8.3。

qRT-PCR 定量表达分析显示，JmSOC1基因在雌雄花蕾、果实、叶和茎中均有表达，但在雌雄花芽中表达量较高，且在雌花中表达量最高；并且在生理分化期时的雌雄花芽表达量趋于平稳，而到形态分化期时雌雄花芽表达量呈递增趋势，且表达量明显高于生理分化期。

因此，推测JmSOC1基因参与了胡桃楸雌雄花芽发育的全过程，在开花过程中起着重要的调控作用。

研究结果为进一步探索胡桃楸花芽发育的分子机制奠定了基础。

关键词：胡桃楸；花芽发育；JmSOC1基因；表达分析中图分类号：S792.13文章编号：1000-1700（2023）06-0673-10
文献标识码：A
开放科学（资源服务）标识码（OSID):
Cloning and Expression Analysis of JmSOC1,a Gene Related to Flower
Formation in Nutmeg
ZHANG Li-jie,DONG Tian-yi,WU Jing-wen,ZHANG Meng-meng,
JIA Ruo-xue,LIU Chun-ping
（College of Forestry/Key Laboratory of Forest Tree Genetics,Breeding and Cultivation of Liaoning Province,
Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China ）
Abstract ：SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)has been proven to be a key factor in regulating flower bud development in Arabidopsis .Juglans mandshurica is an important woody tree species that can be used for both oil and fruit,and its flowering characteristics of hermaphroditism are unknown.To explore the regulatory role of SOC1gene in the development of dioecious flower buds in Juglans mandshurica and the molecular mechanism of promoting early flowering,this study used transcriptome data from J.mandshurica flower buds to obtain the CDS sequence of SOC1gene.The full length of the cDNA sequence of SOC1gene was cloned using PCR amplification technology,and its biological information was analyzed;At the same time,qRT-PCR was used to quantitatively analyze the expression of SOC1gene in different organs and tissues of J.mandshurica ,as well as in different developmental stages of male and female flower buds.The results showed that the cDNA sequence of the JmSOC1gene related to flower formation in J.mandshurica had a total length of 705bp,encoding 234amino acids;Bioinformatics analysis showed that the molecular weight of JmSOC1protein is 21569.04Da;The theoretical isoelectric point (pI)value is 8.3.QRT-PCR analysis showed that the JmSOC1gene was expressed in both male and female flower buds,fruits,leaves,and stems,but the expression level
was higher in both male and female flower buds,and the expression level was highest in female flowers;And during the physiological differentiation stage,the expression level of male and female flower buds tends to stabilize,while during the morphological
differentiation stage,the expression level of male and female flower buds showed a gradual increasing trend,and the expression level
was significantly higher than that during the physiological differentiation stage.Therefore,it is speculated that the JmSOC1gene
is
--沈阳农业大学学报第54卷
involved in the entire process of male and female flower bud development in J.mandshurica ,and plays an important regulatory role in the flowering process.The results of this study lay a foundation for further exploring the molecular mechanism of flower bud development in J.mandshurica .
Key words ：Nutmeg;flower bud development;JmSOC1gene;expression analysis
树木成花的转变，即从营养生长到生殖生长的转变，这是植物生命周期中一个重要的发育过程，对繁殖的成功至关重要。

在模式植物拟南芥中已经确定了5种控制开花的途径：春化途径、光周期途径、自主途径、赤霉素和年龄途径[1]。

这些途径汇聚在一起调控了开花位点FT 、CO1、FLC 基因过表达，以及SOC1/AGAMOUS-like 20（AGL20）、LFY 等几个开花通路整合子基因的表达[2-3]。

SOC1编码MADS-box 蛋白，是包含高度保守的DNA 结合结构域MADS-box 转录因子家族的成员。

SOC1整合了来自光周期、温度、激素和年龄途径相关的多种开花信号[4-6]。

春化途径中FLC 基因结合SOC1和FT 启动子的相应调控元件，直接或间接地抑制SOC1基因的表达[7]；在光周期途径中，SOC1基因的表达可通过CONSTANS （CO ）基因在长日照（LD ）条件下上调促进开花[8]；短日照（SD ）条件下，SOC1基因也受到赤霉素（gibberellins,GA ）的正向调节[9]；在年龄相关通路中，miRNA156靶向的SQUAMOSA PROMOTER BINDING protein-like （SPLs ）和其他转录因子参与了SOC1基因的上调[10]。

SOC1属于MADS-box 基因的SOC1/TOMATO MADS3（TM3）分支；先前的研究已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana ）等多个物种中描述了其同源物[11-14]。

SOC1基因广泛表达于各种组织中，包括根、叶、茎分生组织和花器官原基[15]，并且它们的表达量在花发育的时期增加[16]。

研究表明，SOC1基因过表达导致一些植物物种能够提前开花[17-18]。

胡桃楸（Juglans mandshurica ）又名核桃楸、山核桃，属胡桃科（Juglandaceae ），胡桃属（Juglans ），是一种落叶阔叶乔木[19]，与水曲柳（Fraxinus mandehurica ）、黄菠萝（Phellodendron amurense ）并称为我国东北地区“三大硬阔”。

胡桃楸是国家Ⅱ级珍稀树种，具有重要的经济价值、营养价值、药用价值和观赏价值，因此具有广阔的发展前景。

课题组前期对胡桃楸生殖生物学研究发现，该物种是典型的雌雄同株异型异熟植物，雌先型和雄先型雌雄花芽交替开花授粉有效避免了自交的发生[20-21]。

为探讨胡桃楸花发育过程的分子调控机理，本研究以胡桃楸花芽为试材，通过PCR 扩增获得SOC1基因CDS 序列全长，并对其进行生物信息学分析；利用实时荧光定量表达分析，探讨JmSOC1基因在胡桃楸花发育过程中表达模式，为进一步探究胡桃楸成花的分子机理奠定理论基础。

1
材料与方法
1.1
材料
2022年试验在辽宁省林木遗传育种与培育重点实验室进行。

试验材料分别取自于生理分化期（4月2日、4月10日、4月14日、4月24日、4月30日）和形态分化期（5月4日、5月13日、5月17日、5月20日、5月22日）的胡桃楸叶片，茎段，雌、雄花芽，以及9月初成熟的果实，液氮将其速冻后保存于-80℃超低温冰箱备用。

1.2引物设计
利用转录组数据筛选SOC1基因CDS 序列设计上下游引物（表1）。

引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3
胡桃楸基因组RNA 的提取及cDNA 的合成
利用天根生物公司的RNAsecure Plant Kit 试剂盒，提取胡桃楸叶片、果实、茎、雌花芽、雄花芽的RNA 。

获得的RNA 产物用核酸蛋白仪（Thermo ）进行核酸质量及纯度的检测。

利用上海生工M-MuLV 的cDNA 反转录试剂盒进行cDNA 合成，按说明书在冰上操作。

1.4PCR 扩增
以合成的cDNA 作为模板，使用LA Taq Mix （TAKARA ）完成PCR 扩增。

1.5
胡桃楸SOC1基因CDS 序列克隆
反应扩增程序：95℃，5min ；94℃，30s ，55℃，1min ，72℃，1min ，35个循环；72℃，7min ，4℃∞。

PCR 反应
体系(25μL)：9.5μL ddH 2O ，加入10μmol·L -1F 端引物1μL ，10μmol·L -1R 端引物1μL ，加入模板DNA1μL ，加入LA Taq Mix 12.5μL ，体系共25μL 。

扩增后产物用1%
琼脂糖凝胶电泳检测。

表1
胡桃楸SOC1基因CDS 序列扩增引物
Table 1Primers used for CDS of the Juglans mandshurica 674
--
第6期张丽杰等：胡桃楸成花相关基因JmSOC1克隆和表达分析1.6
目的片段回收、连接、转化
将产物通过胶回收试剂盒（中科瑞泰）完成回收，并利用pGM-T18克隆载体做连接载体过夜连接，转化至DH5α
大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选并进行菌液PCR 鉴定，条带单一且位置正确的菌液，送生工生物公司测序分析。

1.7
qRT-PCR
使用上海生物公司M-MuLV 的cDNA 试剂盒反转录合成胡桃楸叶片、茎、雌雄花芽、果实等cDNA ，利用兰博利德荧光定量试剂盒进行qRT-PCR 验证，按照说明书进行冰上操作，分析SOC1基因在胡桃楸不同器官组织以及雌雄花芽发育时期的表达情况。

2
结果与分析
2.1
胡桃楸核酸质量和浓度检测
将提取的胡桃楸基因组RNA 用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

由图1可知，RNA 条带为2条谱带，清晰明亮，说明RNA 完整性较好，且OD 260/OD 280比值均为1.85～1.93，可满足后续试验要求。

2.2
胡桃楸SOC1基因的CDS 序列克隆
以反转录合成的cDNA 为模板，经PCR 扩增后获得一条长度约为700bp 的特异性条带（图2）。

与pMD18-T 载体连接、回收并完成大肠杆菌的转化，挑选单克隆菌落，进行菌液PCR 检测，经测序后分析该基因序列长度为705bp ，编码234个氨基酸，并且具有完整的开放阅读框（ORF ），表明已克隆获得了胡桃楸SOC1基因CDS 序列（图3）。

图2胡桃楸SOC1基因的PCR 扩增
Figure 2
Juglans mandshurica SOC1amplification results
图1
胡桃楸RNA 提取
Figure 1
RNA electrophoresis of Juglans mandshurica 2.3胡桃楸成花相关JmSOC1基因生物信息学分析2.3.1
胡桃楸JmSOC1基因同源性分析
在NCBI 数据库中对胡桃楸SOC1基因的CDS 序列进行Blast 同源性比
较。

根据比对结果，可以发现胡桃楸与美国山核桃（Carya illinoinensis ）和核桃（Juglans regia ）的SOC1基因同源性高达98%，与欧榛（Corylus avellana ）核苷酸同源性达到87%，与银白杨（Populus alba ）的SOC1基因同源性均达到84%，与大豆（Glycine max ）、栓皮栎（Quercus suber ）同源性达到78%以上。

说明本研究已成功克隆出胡桃楸SOC1基因。

因此，将胡桃楸成花相关SOC1基因命名为JmSOC1基因（表2）。

2.3.2
胡桃楸JmSOC1基因编码的蛋白质结构及理化性质分析
通过Prot Param Ex PASy 在线软件分析胡桃楸
JmSOC1基因的氨基酸序列理化参数，结果表明：其蛋白质分子式为C 1165H 1937N 351O 363S 13，分子量为27086.11，理论等电点pI 值为9.00，不稳定指数为64.68，为不稳定蛋白。

利用DNAMAN 软件对胡桃楸JmSOC1蛋白氨基酸组
成进行分析（图4），发现JmSOC1氨基酸组成中谷氨酸（E ）最多，为13.2%；亮氨酸（L ）、精氨酸（R ）和丝氨酸（S ）次之，分别为9.8%、9.0%和8.5%；并且，此蛋白质中不含色氨酸（W ）、酪氨酸（O ）和硒半胱氨酸（U ）。

其中带正电荷总数为40个，带负电荷酸性氨基酸为34个，即整个蛋白质带正电荷。

2.3.3
胡桃楸JmSOC1基因编码的蛋白质疏水性/亲水性及跨膜预测分析
使用DNAMAN 对上述胡桃楸Jm⁃
SOC1基因序列进行亲水性分析（图5），发现其大部分图像分布于负半轴，也就是说，该蛋白质属亲水蛋白。

通过在线分析软件TMHMM2.0对该基因编码的蛋白质进行跨膜预测，横坐标代表蛋白质各个氨基酸的位
置，纵坐标为跨膜区域的可能性。

若两者相交则代表此处经过了跨膜。

由图6可知，该序列的全部氨基酸均位于细胞膜的外侧，且无跨膜结构。

1
2
500bp
M
1234
675
--沈阳农业大学学报第54卷
2.3.4胡桃楸JmSOC 1基因编码的蛋白质保守结构域及亚细胞定位预测使用在线软件Plant-m PLoc 来预测
该蛋白可能存在的位置，结果表明该蛋白存在于细胞核。

利用NCBI 中的CDD 数据库对JmSOC1蛋白保守区结构域进行预测（图7），发现胡桃楸JmSOC1蛋白含有MADS_MEF2_like 和保守结构域，隶属于MADS 超级家族和K-Box 超级家族。

基因Gene JrSOC1CcSOC1CaSOC1PaSOC1GmSOC1QsSOC1
GenBank 登录号
Accession number of its protein
XP_018820385.1XP_042951334.1XP_059456278.1XP_034904415.1NP_001236377.1XP_023900830.1
同源/%Simlarity 989887847978
植物种类Species
核桃Juglans regia
美国山核桃Carya illinoinensi
欧榛Corylus avellana 银白杨Populus alba 大豆Glycine max 栓皮栎Quercus suber
表2
胡桃楸JmSOC1同源基因氨基酸序列与其他物种同源性比较
Table 2
Comparison of amino acid sequence of JmSOC1homologous gene between Juglans mandshurica and other species
102030405060
1ATGTGTGTTTGCTGTCATAGTGAGTCTCATTTTCTTCTCAAAGGTGTAGAGATGGTGAGA 1M C V C C H S E S H F L L K G V E M V R 70809010011012061GGAAAGACTCAGATGAGGCGCATAGAGAACGCCACAAGCAGGCAAGTGACCTTCTCCAAG 21G K T Q M R R I E N A T S R Q V T F S K 130140150160170180121AGGCGAAATGGGCTGCTAAAGAAAGCGTTTGAGCTATCAGTGCTGTGTGATGCCGAGGTT 41R R N G L L K K A F E L S V L C D A E V 190200210220230240181GCACTCATAATTTTCTCTCCCAGGGGCAAGCTCTATGAATTTGCAAGTTCCAGCATGCAG 61A L I I F S P R G K L Y E F A S S S M Q 250260270280290300241GAGACAATAGATCGCTACCGGAGGCACACAAAAGAGATTCAAATTAACAATAAATCTGTT 81E T I D R Y R R H T K E I Q I N N K S V 310320330340350360301GAACAAAACATGCAGCACTTGAGGATTGAATCAACAAACATGATGAAGAAGATTGAGCTT 101E Q N M Q H L R I E S T N M M K K I E L 370380390400410420361CTTGAAGTTTCGAAACGGAGACTCCTGGGAGAAGGCTTGGGATCATGCTCTATTGAAGAG 121L E V S K R R L L G E G L G S C S I E E 430440450460470480421CTACAACAGATAGAACAACAGTTAGAGAGGAGCGTAAACAAAGTTAGAGCAAGAAAGACT 141L Q Q I E Q Q L E R S V N K V R A R K T 490500510520530540481CAGGTTTTCAAGGAACAAATCGAGCAACTAAAAGAGAAGGAGAAAGCTCTAGCAGAGGAA 161Q V F K E Q I E Q L K E K E K A L A E E 550560570580590600541AACGCAAGGCTATCCGAGAAGTGTGGTATTCAATTACCACAGACAGCAATAAATGAGAAT 181N A R L S E K C G I Q L P Q T A I N E N 610620630640650660601AGAGAAATTTCTGCTTACGAAGAAAGTACTCCGAGTTCAGATGTGGAGACTGAATTGTTC 201R E I S A Y E E S T P S S D V E T E L F 670680690700
661ATTGGACTGCCGGAAAGGAGAGCAAAGCGCCTCCCACAGAATTGA 221
I G L P E R R A K R L P Q N *
图3胡桃楸SOC1基因CDS 序列
Figure 3CDS sequence of SOC1gene in Juglans mandshurica
676
--
第6期
张丽杰等：胡桃楸成花相关基因JmSOC1克隆和表达分析可能性P r o b a b i l i t y
1.21.00.80.60.40.20
跨膜Tranmembrane
内部Inside
外部Utside
200
150
100
50
Ala.丙氨酸Alanine ；Arg.精氨酸Arginine ；Asn.天冬酰胺Asparagine ；Asp.天冬氨酸Asparticacid ；Cys.半胱氨酸Cysteine ；Gln.谷氨酰胺Glutamine ；Glu.谷氨酸Glutamicac⁃
id ；Gly.甘氨酸Glycine ；His.组氨酸Histidine ；Ile.异亮氨酸Isoleucine ；Leu.亮氨酸Leucine ；Lys.赖氨酸Lysine ；Met.蛋氨酸Methionine ；Phe.苯丙氨酸Phenylalanine ；Pro.脯
氨酸Proline ；Ser.丝氨酸Serine ；Thr.苏氨酸Threonine ；Trp.色氨酸Tryptophan ；Tyr.酪氨酸Tyrosine ；Val.缬氨酸Valine
图4
胡桃楸JmSOC1基因所编码的蛋白质氨基酸组成
Figure 4
The amino acid composition of Juglans mandhurica JmSOC1gene encoded protein
占比P r o p o r t i o n /%
14121086420
氨基酸Amino acid
Ala Arg Asn.Asp.Cys.Gln.Glu.Gly.His.Ile.Leu.Lys.Met.Phe.Pro.Ser.Thr.Trp.Tyr Val Pyl Sec
图5
胡桃楸JmSOC1基因所编码的蛋白质疏水性/亲水性
Figure 5
Hydrophobic/hydrophilic of Juglans mandshurica JmSOC1gene
疏水性H y d r o p h o b i c i t y
543
210
-1.0-2.0-3.0-4.0-5.0
位置Postion
234
176
118
59
1
图6
胡桃楸JmSOC1基因所编码的蛋白质跨膜预测
Figure 6
Transmembrane prediction of the protein encoded by JmSOC1gene related to flower formation
of Juglans mandshurica
2.3.5胡桃楸JmSOC1基因编码蛋白聚类分析利用MEGA7.0生物软件对包含JmSOC1基因在内的20个物种的
SOC1基因编码的氨基酸构建系统进化树。

由图8可知，胡桃楸JmSOC1蛋白首先与核桃JrSOC1的亲缘关系最近，然后依次为美国山核桃CiSOC1、山核桃（Carya cathayensis ）CcSOC1、欧榛CaSOC1、夏栎（Quercus robur ）QuSOC1、白栎（Quercus lobata ）QlSOC1、欧洲栓皮栎（Quercus suber ）QsSOC1聚在一个分支上，与杨树PaSOC1、大
蛋白质长度Protein length/kD
677
--沈阳农业大学学报第54卷
图7
胡桃楸JmSOC1基因所编码的蛋白质保守结构域分析
Figure 7
Conservative domains analysis of the protein encoded by Juglans mandshurica JmSOC1gene
Conserved domains on [lcl |seqsig_ATGTG_2a24c2868ce99d380251c5a998d62bab]View Concise Results
Local query sequence
Zoom to residue level show exctra options>
708
675600525450
375
300225150751RF +1DNA binding site K-box
pfam01486
K-box region.The K-box regiom is commonth found associated with SRF-tvce transcription...
313-584
1.73e-27
dimerization interface
putative phosphorylation site
MADS_MEF2_lke cd00266MEF2(myocyte enhancer factor2)like/Type ll subtamily of MADS (MCM1,Agamous.Deficiens,..58-273 5.34e-42Nama
Accession
Description Interval
E.value
Speaifie hits Superfanilies
MADS_MEF2_like MADS superfamily
K-box
K-box superfamily
Search for sar demin anchiictures
Refine search
豆GmSOC1、葡萄（Vitis riparia ）ViSOC1等12个物种的SOC1基因亲缘关系稍远，聚在其他的分支上。

将胡桃楸成花相关JmSOC1基因编码蛋白质的氨基酸序列与核桃、欧榛、夏栎、白栎等其他物种SOC1蛋白氨基酸序列进行比对结果如图9，可以发现胡桃楸成花相关JmSOC1蛋白具MADS 结构域。

2.3.6
胡桃楸JmSOC1基因编码的蛋白质二级结构的预测
通过在线分析软件SOPMA 预测分析胡桃楸成花相
关JmSOC1基因编码的蛋白质二级结构。

结果表明（图10），该基因的编码蛋白主要有4种二级结构。

其中无规卷曲占25.21%，延伸链占10.26%，β-折叠占5.56%，α螺旋占58.97%。

2.4胡桃楸JmSOC1基因荧光定量表达分析
2.4.1
胡桃楸JmSOC1基因在不同器官组织中的表达分析
以Actin 为内参基因，在胡桃楸不同器官中对JmSOC1
的表达进行了分析。

由图11可知，胡桃楸JmSOC1基因在不同器官组织中均有表达，其相对表达量为雌、雄花芽中表达量较高，且雌花芽表达量最高，而在果实、叶片和茎次之，说明JmSOC1基因参与了胡桃楸花芽发育的整个过程，并且主要参与雌花芽的发育，从而可以推测出JmSOC1基因在胡桃楸的成花过程中起到了重要作用。

JrSOC1.核桃Juglans regia ；CaSOC1.美国山核桃Carya illinoinensi ；CcSOC1.山核桃Carya cathayensis ；CaSOC1.欧榛Corylus avellana ；QrSOC1.夏栎Quercus robur ；QlSOC1.山谷白栎Quercus lobata ；QsSOC1.欧洲栓皮栎Quercus suber ；DmSOC1.榴梿Durio zibethinus ；GmSOC1.大豆Glycine max ；VrSOC1.葡萄Vitis riparia ；PaSOC1.杨树Populus alba ；VuSOC1.赤小豆Vigna umbellata ；ApSOC1.相思子Abrus precatorius ；CsSOC1.橙子Citrus sinensis ；HbSOC1.橡胶树Hevea brasiliensis ；VaSOC1.赤豆Vigna angularis ；
VbSOC1.小果葡萄Vitis balansana ；GsSOC1.野大豆Glycine soja
图8
胡桃楸JmSOC1基因所编码的蛋白质的系统进化树
Figure 8
Phylogenetic tree of proteins encoded by JmSOC1gene related to flowering of Juglans mandshurica
JmSOC1
J r S O
C 1
V r S
O C
1
V b S O C 1
P a S O C 1
HbSOC1
D z S O
C 1C s
S O
C 1
A p S O
C 1
V u S
O C 1
V a S C O 1
G s S O C
1
G m
S O C 1
Q s
S O
C 1
Q r S O C 1
Q l S O C
1C a
S O
C 1
C
c S O C 1
C i S O
C 1678
--
第6期张丽杰等：胡桃楸成花相关基因JmSOC1克隆和表达分析
黄色.无规卷曲；红色.延伸链；绿色.β-折叠；蓝色.α螺旋
Yellow.Random coil;Red.Extended strand;Green.Beta turn;Blue.Alpha helix
图10
胡桃楸JmSOC1蛋白质二级结构预测
Figure 10
Prediction of JmSOC1protein secondary structure in Juglans
mandshurica
2.4.2
胡桃楸JmSOC1基因在不同发育时期雌雄花芽
中的表达
以Actin 为内参基因，对胡桃楸4月2日至5月
22日4种花芽中SOC1基因的表达模式进行了分析。

其中4月2日至4月30日为胡桃楸花芽生理分化期，5月1日以后为胡桃楸雌雄花芽形态分化期。

由图12可知，Jm⁃SOC1基因在生理分化期4种花芽发育过程中的表达量相对稳定，随着雌雄花芽的发育，从4月10日以后开始出现显著性差异；而在生理分化期末期，进入到形态分化期（5月1日后）时JmSOC1基因的表达量开始呈现一个持续递增的状态，尤其在5月13日至5月22日期间属于雌雄花交替开放时期，JmSOC1基因的表达量交替出现高峰。

因此推测JmSOC1基因在胡桃楸花芽发育的形态分化期起了重要调控作用。

由图13可知，胡桃楸生理分化期的雌花芽在雌雄先型花芽发育过程中JmSOC1基因的表达相对比较稳定（4月2日至4月中旬）未出现显著性差异（p >0.05），4月下旬JmSOC1基因的表达量在雌雄先型雌花芽中表达量开始出现显著性差异（p <0.05）；进入到形态分化期（5月初）JmSOC1基因在两种类型的雌花芽中表达量逐渐升高，5月13日至5月22日正值雌花开放时期，此时的雌雄先型雌花芽交替开放，JmSOC1基因的表达量亦呈现交替升高或下降的趋势（图13A ）；而雌雄先型雄花芽的发育在生理分化期时JmSOC1基因的表达量也是相对稳定的（4月2日），没有显著性差异（p >0.05），从4月10日开始两种类型的雄花芽JmSOC1基因的表达量开始出现差异；进入到形态分化期后JmSOC1基因在雄先型雄花芽中表达量呈现升高下降升高的趋势，而在雌先型中雄花芽的表达量一直呈现逐渐升高的趋势，到5月22日雌先型雄花芽最后散粉时JmSOC1基因表
达量达到最高值（图13B ）。

从胡桃楸雌雄先型两种生殖类型分析，可以看出JmSOC1基因在雌先型生理分化初期即4月2日时雌雄花芽的表达量没有显著差异图9胡桃楸JmSOC1蛋白质与其他物种同源蛋白质氨基酸序列比对Figure 9
Amino acid sequence comparison between Jm-SOC1and homologous proteins of other species
CaS0C1.seq
CiS0C1.seq DzS0C1.seq GmS0C1.seq JmS0C1.seq JrS0C1.seq Q1s0C1.seq QrS0C1.seq QsS0C1.seq VrSOC1.seq Consensus
40
404040404040404040CaS0C1.seq CiS0C1.seq DzS0C1.seq GmS0C1.seq JmS0C1.seq JrS0C1.seq Q1s0C1.seq QrS0C1.seq QsS0C1.seq VrSOC1.seq Consensus 80808080808080808080CaS0C1.seq CiS0C1.seq DzS0C1.seq GmS0C1.seq JmS0C1.seq JrS0C1.seq Q1s0C1.seq QrS0C1.seq QsS0C1.seq VrSOC1.seq Consensus 119119117119119119119119119120CaS0C1.seq CiS0C1.seq DzS0C1.seq GmS0C1.seq JmS0C1.seq JrS0C1.seq Q1s0C1.seq QrS0C1.seq QsS0C1.seq VrSOC1.seq Consensus 159159157159159159159159159160CaS0C1.seq CiS0C1.seq DzS0C1.seq GmS0C1.seq JmS0C1.seq JrS0C1.seq Q1s0C1.seq QrS0C1.seq QsS0C1.seq VrSOC1.seq Consensus 197199195197198198197197197198CaS0C1.seq CiS0C1.seq DzS0C1.seq GmS0C1.seq JmS0C1.seq JrS0C1.seq Q1s0C1.seq QrS0C1.seq QsS0C1.seq VrSOC1.seq Consensus
217219215209218215217217217218
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学
报第54卷
（p >0.05），之后（4月10日）随着花芽的发育，JmSOC1基因在雌雄花芽中的表达量出现显著差异（p <0.05），进入到形态分化期后JmSOC1基因在雌先型的雌雄花芽中表达量呈现逐渐升高趋势，到5月22日雌先型雄花芽散粉时JmSOC1基因表达量到达最高，雌花芽此时已完成授粉表达量呈下降趋势（图13C ）。

而雄先型胡桃楸在生理分化期时雌雄花芽JmSOC1基因的表达量在4月10日之前没有显著性差异（p >0.05），4月中旬之后一直到形态分化期JmSOC1基因在雌花芽和雄花芽中的表
达量均呈显著性差异（p <0.05）（图13D ）。

综上所述，推
测JmSOC1基因在胡桃楸花芽发育整个过程中起到了重要的调控作用。

图11胡桃楸JmSOC1基因在不同组织中的表达Figure 11
Expression of Juglans mandshurica JmSOC1
in different tissues
cc.雌先型雌花芽；cx.雌先型雄花芽；xx.雄先型雄花芽；xc.雄先型雌花芽
cc.Female primordial female flower bud;cx.Female prokaryotic male flower bud;xx.Androgenic male flower bud;xc.Male primordial female flower bud
图12
胡桃楸JmSOC1基因在不同发育时期4种花芽中的表达
Figure 12
Expression of JmSOC1gene in four flower buds of Juglans mandshurica at different developmental stages
3讨论与结论
高等植物从营养生长转变为生殖生长，代表着植物童期的结束，因此，成花是植物生命周期中至关重要的
过程。

在拟南芥研究中已证明编码MADS-box 转录因子的SOC1基因主要在发育中的叶片和分生组织中表达，是春化途径、自主途径和光周期途径中控制开花的重要整合因子[22]。

在光周期通路中，CONSTANS （CO ）基因被认为是调控的中心，是第一个被标记的桥梁基因[23]，它可以通过延长或缩短植物暴露在光照下的时间来调节开花的提前或延迟[24]。

用糖皮质激素（GR ）处理转基因植物中SOC1基因表达证实了SOC1基因是CO 的下游靶基因，SOC1基因也具有正向调控作用，过表达SOC1基因会使CO 晚花突变体的花期提前[25]。

当SOC1基因有缺陷时35S:CO 早花型会延迟开花；赤霉素途径是由于SOC1在促进开花过程中调控LFY 转录而控制开花[26]；在自主通路中，抑制FLC 基因的表达，促进植物开花[27]。

春化途径通过降低植物所处环境的温度来诱导植物开花。

通过观察冬季一年生植物春化处理证实：春化后FLC 的表达受到抑制，从而上调SOC1基因的表达促进开花[28]。

研究表明，随着低温处理时间的延长，FLC 基因的表达逐渐减少，从而使FLC 的抑制作用减弱[29]。

综上所述，SOC1基因在春化和自主神经通路中均受到FLC 基因的抑制。

在年龄通路中，植物的生长分为“未成年期”和“成熟期”，只有进入成熟期，植物才能感知到开花信号，从而进入开花期。

SOC1基因的表达也受植物发育年龄的影响，年龄途径对SOC1的调控不依赖于光周期途径[30]。

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第6期张丽杰等：胡桃楸成花相关基因JmSOC1克隆和表达分析发育过程相关通路中的SFL （SQUAMOSA PROMOTER BIN DINGPROTEIN-LIKE ）家族转录因子参与了SOC1表达的调控[31]。

SOC1基因是一个重要的开花整合子，整合这些开花通路中的信号，激活下游上层分生组织特征基因的表达，促进植物开花。

这表明SOC1是植物从营养生长向生殖生长过渡的关键基因。

本研究克隆获得胡桃楸成花相关JmSOC1基因CDS 序列长为705bp ，编码234个氨基酸。

NCBI 数据库Blast 比对表明：JmSOC1基因与其他物种的SOC1基因同源性均在70%以上。

生物信息学分析发现胡桃楸Jm⁃SOC1蛋白分子式为C 1165H 1937N 351O 363S 13，分子量为27086.11，理论等电点pI 值为9.00；利用q RT-PCR 对JmSOC1基因在不同器官组织中表达进行分析，结果表明：JmSOC1基因在雌雄花蕾、果实、叶和茎中均有表达，但在雌雄花芽中表达量较高，在雌花中表达量最高。

并且4种花芽在生理分化期表达量趋于平稳，到达形态分化期时JmSOC1基因的表达量呈递增趋势，且表达量明显高于生理分化期。

因此，推测JmSOC1基因参与了胡桃楸雌雄花芽发育的全过程，在开花过程中起着重要的调控作用。

研究结果为后续探明胡桃楸花发育的分子调控机理，构建花发育调控基因网络奠定理论基础。

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cc.Female primordial female flower bud;cx.Female prokaryotic male flower bud;xx.Androgenic male flower bud;xc.Male primordial female flower bud
图13
不同时期胡桃楸JmSOC1基因在4种花芽中的表达
Figure 13
Expression of JmSOC1gene related to flower formation in four flower buds of Juglans mandshurica
at different
stages
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[责任编辑马迎杰]。