蛇床子素脂质体的制备及表征

蛇床子素脂质体的制备及表征
赵凯燕; 张丹参; 苏晓梅; 张海威; 侯文书
【期刊名称】《《神经药理学报》》
【年(卷),期】2017(007)005
【总页数】7页(P21-27)
【关键词】蛇床子素; 脂质体; 乙醇注入法; 冻干脂质体
【作者】赵凯燕; 张丹参; 苏晓梅; 张海威; 侯文书
【作者单位】河北科技大学化学与制药工程学院石家庄 050000 中国; 河北北方学院药学系张家口 075000 中国
【正文语种】中文
【中图分类】R944.1
蛇床子素（osthole，Ost）是伞形科植物蛇床子中的重要活性单体，中药蛇床子能增强免疫系统、提高男性性功能、除风除湿，它的这些功效主要归因于活性单体蛇床子素。

现代研究表明，蛇床子素具有多种药理作用，如抗炎［1-2］、抗凋亡［3］、利尿及安神［4］等作用。

近年许多学者探究了蛇床子素和中药蛇床子的神经保护作用。

Ost 可以通过调节离子通道的G 蛋白偶联受体活动来影响神经和神经内分泌功能。

Ost 能够在细胞内以状态和频率依赖性方式阻断电压门控钠离子通道［5］，以浓度依赖性方式抑制电压依赖型L 型钙离子通道［6］。

Ost 被认为是体内神经递质γ-氨基丁酸
（gamma-aminobutyric acid，GABA）的调节剂［4］，这也是它起到抗癫痫作用的一种机制。

Ost 在体内或体外的神经退行性疾病模型中，表现出神经保护作用。

在使用神经毒素MPP+诱导PC12 细胞损伤建立的帕金森病（Parkinson's disease，PD）体外细胞模型中，Ost 有效提高了PC12 细胞存活率［7］。

Ost 水溶性差、口服生物利用度低的性质，限制了蛇床子素的应用，所以选择合适的制剂技术来解决这些问题，是蛇床子素新剂型开发面临的重要挑战。

使用脂质体包封水溶性差的药物，可以增加药物的溶解度和生物利用度。

本章首先通过紫外分光光度法建立蛇床子素的含量测定方法，通过脂质体制备方法的筛选，选择乙醇注入法制备蛇床子素脂质体（Ost-Lips），单因素筛选和正交实验优化制备处方后，对脂质体包封率、电位、粒径、透射电镜下形态进行研究，最后制备其冻干制剂。

1 实验材料
1.1 药品与试剂
蛋黄卵磷脂PC-98T，注射级，AL15018，购自日本丘比株式社会；胆固醇，注射级，B41239，购自日本精化株式会社；蛇床子素，wkq16051804，购自四川省
维克奇生物科技有限公司；蛇床子素标准品，110822-201308，购自中国食品药
品检定研院；葡聚糖G-50 凝胶，727A067，购自北京索莱宝；甘露醇；其余试
剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器
电子天平，BT 224S，德国Sartorius；蠕动泵，BT100-2J，保定兰格恒流有限公司；旋转蒸发器，RE201D，巩义市英裕高科仪器厂；粒度分析仪，ZEN3690，
英国Malvern 公司；透射电镜，H-7650，日本日立公司；高速离心机，4-15，
美国Sigma；真空冷冻干燥机，MODUL YOD-230，美国 Thermo Fisher。

2 方法与结果
2.1 蛇床子素测定方法
2.1.1 检测波长
用乙醇定溶适量蛇床子素标准品和空白脂质体（辅料）后，置于10 mL 容量瓶中。

以乙醇为参比，在200～700 nm 波长处进行光谱扫描。

结果显示蛇床子素标准品最大吸收波长为322 nm，且在该波长处空白脂质体对其测定没有明显干扰，故选择检测波长为322 nm。

2.1.2 线性关系考察
精密称取蛇床子素标准品，加乙醇溶解并定容至100 mL 容量瓶中，配制成标准
贮备液，精密量取上述标准贮备液一定量配制浓度为3，4，7，9，12，13
μg·mL-1的系列标准溶液，于322 nm 波长处测定吸光度值。

以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归分析，得到回归方程y=0.0615x+0.0019
（R2=0.9996），如图Fig.1。

Fig.1 Standard curve for Ost
2.1.3 精密度考察
精密移取储备液配置成低（3 μg·mL-1）、中（7 μg·mL-1）、高（12 μg·mL-1）三个浓度的蛇床子素标准品溶液，分别在一天内测定5 次，并连续测定3 d。

考察方法的精密度。

结果见Tab.1，三种浓度的Ost 样品日内、日间精密度相对标准
偏差（relative standard deviation，RSD）均小于2%，精密度良好。

Tab.1 Precision of determination for Ost（μg·mL-1）Intra-day Inter-day Mean±SD RSD（%）Mean±SD RSD（%）3 0.192±0.004 1.935
0.194±0.002 1.099 7 0.426±0.002 0.539 0.429±0.003 0.618 12 0.745±0.002 0.305 0.752±0.004 0.495 C
2.1.4 回收率考察
精密移取储备液配置成低（3 μg·mL-1）、中（7 μg·mL-1）、高（12 μg·mL-1）
三个浓度的蛇床子素标准品溶液，加入处方比例的空白脂质体，分别测定紫外吸收，计算回收率，结果见Tab.2。

由表内数据可知，三种浓度的Ost溶液回收率均在1 左右，RSD 小于2%，回收率良好。

Tab.2 Recovery of determination of Ost（n=5）Addition（μg·mL-1）Recovery RSD（%）3.000 1.049 0.659 7.000 0.996 0.203 12.00 1.018 0.242 2.15 包封率测定方法
使用微柱离心法［8］测定脂质体包封。

率将葡聚糖凝胶Sephadex G-50 浸泡在
蒸馏水中过夜，充分溶胀。

取2.0 mL（湿体积）装于2.5 mL 注射器中，以转速2 000 r·min-1 离心3 min 脱水，得葡聚糖凝胶柱，放置于10 mL 离心管中备用。

取200 μL 制备好的脂质体溶液，用乙醇定容到10 mL 的容量瓶中，322 nm 测
定紫外吸收A0。

移取200 μL 脂质体缓慢滴加入准备好的G-50 微柱中，3 000 r·min-1离心4 min，收集离洗脱液后，再于柱顶缓慢滴加200 μL超纯水，3
000 r·min-1 离心4 min，收集洗脱液并重复3 次，将洗脱液移至10 mL 容量瓶
内用乙醇定容，并在322 nm 测定紫外吸收A1。

包封率
2.2 蛇床子素脂质体制备方法的选择
2.2.1 薄膜分散法（thin layer hydration）
将适量蛋黄卵磷脂、胆固醇、蛇床子素加入梨形瓶中，加4 mL 氯仿溶解后，置于旋转蒸发仪上，45℃悬蒸40 min，抽尽有机溶剂的同时，使脂质在瓶内形成均匀的薄膜。

向瓶内加入超纯水，置于悬蒸仪上，45℃，100 r·min-1 旋转使薄膜脱离瓶壁并充分融合1 h。

将水合溶液倒入高压匀质机，8 000 kpa 循环3 min，得到半透明脂质体溶液［9］。

2.2.2 乙醇注入法（ethanol injection）
将适量蛋黄卵磷脂、胆固醇、蛇床子素溶于少量乙醇中，取超纯水置于50℃水浴
锅中预热，在磁力搅拌下将溶有脂质的乙醇溶液通过蠕动泵匀速滴加至超纯水中，滴加结束后保温搅拌15 min，倒入梨形瓶27℃水浴中抽真空除乙醇［10］。

2.2.3 制剂评价
使用2.1.5 下的测定方法，测定两种方法得到脂质体的包封率，分别适量移取两种方法制备的脂质体，用超纯水稀释5 倍，过0.22 μm 微孔滤膜后，用粒度仪测得其粒径和电位。

结果见Tab.3。

Tab.3 Evaluation of liposomes obtained by different methodsGroup EE（%）Size（nm） Zeta Potential（mV）Thin layer hydration 78.5 147.6 -8.7 Ethanol injection 81.2 120.7 -13.4
结果表明，乙醇注入法制备得到的脂质体包封率较高、粒径较小且分布均匀、电位较高，所以选择乙醇注入法制备脂质体。

2.3 脂质体制备工艺的考察
2.3.1 Ost 加入量
固定EPC 加入量为40 mg，CHOL 加入量为10 mg，水浴温度为50℃，改变
Ost 的加入量，考察不同药酯比对脂质体包封率的影响。

由Fig.2 可知，随着蛇床子素加入量的增加，脂质体的包封率先增加，后降低，在2 mg时得到最大值为83.91%。

实验结果说明脂质体对蛇床子素的包埋具有饱和性，一旦药物超过脂质
膜的饱和度，药物就无法进入脂质体内形成稳定的药物体系。

因此选择Ost 用量
为2 mg。

Fig.2 Effect of Ost addition on encapsulation eff iciency of Ost-Lips
2.3.2 CHOL 加入量
控制EPC 加入量为40 mg，Ost 加入量为2 mg，水浴温度为50℃，改变CHOL 的加入量，考察膜材比对包封率的影响。

如Fig.3，逐渐减小胆固醇的质量，脂质
体的包封率先增大，再逐渐趋于平衡，CHOL 的加入可以提高双分子层的刚性，
但是过多的加入会降低双分子膜流动性，在CHOL 加入量为10 mg，包封率最大为83.57%，CHOL 用量为10 mg。

Fig.3 Effect of CHOL addition on encapsulation eff iciency of Ost-Lips
2.3.3 EPC 浓度
控制CHOL 与Ost 加入量不变，改变EPC 的加入量，考察EPC 浓度对包封率的
影响。

结果见Fig.4，随着EPC 加入量的增加，脂质体的包封率先增大后减小，4 mg·mL-1 时达到最大值83.91%。

当EPC 浓度为5 mg·mL-1、6 mg·mL-1 时，脂质体的稳定性变差，静置药品渗漏严重，后很快产生沉淀。

所以选取EPC 的加
入量为4 mg·mL-1。

Fig.4 Effect of lipid concentration on encapsulation efficiency of Ost-Lips 2.3.4 制备温度
控制膜材EPC 与CHOL、主药Ost 加入量不变，改变制备温度，考察温度对包封率的影响。

如Fig.5，随着水浴温度的增加，脂质体的包封率先升高后降低，在50℃时有最高包封率83.57%，所以选取50℃制备温度。

Fig.5 Effect of temperature on encapsulation eff iciency of Ost-Lips
2.3.5 正交实验确定蛇床子素脂质体配方
在单因素筛选的基础上，以包封率为指标，选用L9（34）正交表，对处方中EPC 加入量、CHOL 加入量、Ost 加入量及制备温度进行实验。

所采取的因素及水见Tab.4，结果见Tab.5，正交实验方差分析见Tab.6。

通过正交实验可以看出，各
个因素的影响程度由大到小为C＞B＞A＞D，最佳处方为C3B1A2D2。

制备温度
为50℃，EPC 浓度为4 mg·mL-1，CHOL 加入量为5 mg，Ost 加入量为2 mg 为最优处方。

2.4 处方验证及脂质体性质考察
2.4.1 包封率的测定
按上述处方制备脂质体，测定脂质体的包封率平均为（83.09±0.56）%（n=3），三次验证实验结果基本一致，所以上述得到的处方工艺可行，重复性良好。

2.4.2 电位及粒径的测定
将脂质体用超纯水稀释5 倍，过0.22 μm 微孔滤膜分别测定粒径、电位分布。

如Fig.6、Fig.7，三批脂质体平均粒径为（101.9±2.7） nm（n=3），PDI 值均小
于0.3，分布良好，电位平均值为（-15.3±2.3） mV（n=3）。

2.4.3 透射电镜下观察形态
取适量脂质体滴在喷碳铜网表面上，放置适当时间使脂质体吸附于其上，以2.0%磷钨酸染色3 min，在透射电镜下观察形态（Fig.8）。

由投射电镜图可以看出脂
质体外观较圆整，但个别有黏连融合或双层膜结构不完整现象，说明脂质体的稳定性有待提高。

Tab.4 Factors and levelsLevels Factors A Temperature（℃） B Concentration of EPC（mg·mL-1） C Addition of CHOL（mg） D Addition
of Ost（mg）1 55 40 18 2.5 2 50 30 10 2 3 45 20 5 1.5
Tab.5 Orthogonal test resultsNumber A Factors B C D EE/%1 42.46 2 1 2 2
2 67.42 1 1 1 1
3 60.20
4 2 1 2 3 82.81 1 3 3 3
5 81.33
6 2 3 1 2 46.86 2 2 3
1 7 82.99 8 3
2 1
3 36.81 3 1 3 2 9 3 3 2 1 49.53 K1 56.69 69.42 42.0
4 57.77 K2 70.33 61.8
5 66.59 65.75 K3 56.44 52.19 74.84 59.94 R 13.64 17.23 32.80 2.17
Tab.6 Variance analysis of orthogonal testSource of variance Sum of squares of deviations Freedom Variance Value of F Value of P A 758.183 2 379.091 1603.639 ＜0.01 894.477 2 447.238 1691.916 ＜0.01 C 3492.445
2 1746.22
3 1891.902 ＜0.01 D 204.591 2 102.296 432.732 ＜0.01 B Error
E 2.128 9
Fig.6 Size distribution of Ost-Lips
Fig.7 Zeta potential of Ost-Lips
Fig.8 Morphology under transmission electron microscope（×20 000）
2.5 冻干脂质体的制备
使用甘露醇做脂质体的冻干保护剂，取1 mL Ost-Lips，加入不同质量比的甘露醇，先在-80℃预冻8 h，再放入-20℃预冻12 h 后，使用冷冻干燥机-50℃冷冻48 h。

取出后使用1 mL 超纯水复溶，测定复溶后脂质体的包封率。

结果见Fig.9，随甘
露醇加入量的增多，复溶后脂质体的包封率先增大，后减小，在用量为8%时有最大值80.04%，得到的冻干粉针剂饼装外观完整，复溶后没有絮凝物，粒径较小，所以最终选用8%为甘露醇的最终加入浓度。

3 讨论
薄膜分散法和乙醇注入法是制备脂质体常用方法，对脂溶性药物均有较好的包封效果。

现有文献中关于Ost-Lips 常使用薄膜分散法制备［11-12］。

本实验中将通
过比较薄膜分散法联合使用高压匀质机与乙醇注入法两种方法制备脂质体，结果表明乙醇注入实验过程中避免使用了有毒有机溶剂，能得到包封率高、粒径较小的脂质体，相较于高压匀质机使用时需要通过调节来达到一定的压力，乙醇注入法避免了操作过程引起的重复性差异。

通过初步筛选，确定乙醇注入法作为Ost-Lips 的
制备方法。

Fig.9 Effect of mannitol additionon encapsulation efficiency of Ost-Lips
微柱离心法是常用的脂质体包封率测定方法。

此法是利用葡聚糖凝胶G-50 表面的网状多孔结构，可以因通过物质的粒径大小进行筛分，粒径小的物体会进入网孔，滤出柱子时间长，粒径大的物体不会进入网孔，滤出柱子时间短。

具有操作简便、重复性高的优点［13］。

冻干法能解决脂质体稳定性差的问题。

目前常用的冻干保护剂为甘露醇、葡萄糖、
海藻糖等糖类物质，这些糖中丰富的羟基结构，可以和磷脂膜结构的极性基团形成氢键，结合于脂质膜结构上，抑制冻干过程中因脱水而导致的脂质膜间距减小，保持脂质双分子层的完整，这种由保护剂代替水做脂质体稳定剂的说法，被成为水代替假说；代替水分子结合于脂质膜的保护剂，还能减少预冻过程中形成的冰晶嵌入脂质膜的几率，从而防止膜材磷脂由凝胶态转变为液晶态时脂质双分子层的破裂和包封药物的泄漏［15］。

Ost 为亲脂性药物，与脂质双层膜结构有较稳定的结合，在本实验中，当冻干保护剂甘露醇用量为8%时，能使脂质体在冻干过程中最少的释放药物，再次水化后，得到较高的包封率。

本实验对Ost 脂质体的制备方法、制备工艺、制剂性质进行了考察，满足2015
版《中国药典》中脂质体包封率需大于80%的要求，并通过冻干改善了脂质体的
稳定性。

本课题组后期将对蛇床子素脂质体使用具有靶向功能的长循环材料进行修饰，使脂质体具有靶向性，提高药物的利用率，减少药物对其他组织的损害。

参考文献
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