新型鹅星状病毒的分离鉴定及卵黄抗体的制备与应用

符号说明
英文缩写英文名称中文名称Amp ampicillin氨苄青霉素
AIV avian influence virus禽流感病毒
ARV avian reovirus呼肠孤病毒
AstV avian astroviruses禽星状病毒
bp base pair碱基对
cDNA complementary DNA互补DNA
CPE cytopathiceffect细胞病变效应
Ct cycle threshold循环阈值
d day天
DEPC diethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯DNA deoxyribonucleotide acid脱氧核糖核酸
dpi day post inoculation接种后第几天DsDNA double-stranded DNA双链DNA
ELISA enzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附试验FBS fetal calf serum胎牛血清
GPV goose parovovirus鹅细小病毒
GPoV goose polyoma virus鹅多瘤病毒
GoCV goose circovirus鹅圆环病毒
h hour小时
IBV Infectious bronchitis virus传染性支气管炎病毒LB luria-bertini medium LB培养基
min minute分钟
MDV Marek’s disease virus马立克病毒
NDV newcastle disease virus新城疫病毒
nm nanometer纳米
OD optical density光密度值
ORF open reading frame开放阅读框PBS phosphate buffered saline磷酸盐缓冲液PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应REV Reticuloendotheliosis Virus网状内皮组织增殖病病毒RNA ribonucleic acid核糖核酸
rpm revolution per minute每分钟转速
RT reverse transcription反转录
S second秒
SPF specific pathogen free无特定病原体TAE tris-acetate EDTA Tris-乙酸电泳缓冲液TCID5050%tissue culture infective dose半数细胞致死量
U unit单位
UA Urate尿酸盐
UTR untranslated region非编码区
目录
中文摘要 (I)
ABSTRACT (III)
1.前言 (1)
1.1病原学 (1)
1.1.1星状病毒的分类 (1)
1.1.2病毒基因组及主要蛋白 (1)
1.1.3培养特性 (3)
1.1.4理化性质 (3)
1.2流行病学及病理变化 (3)
1.3诊断方法 (4)
1.3.1电镜法 (4)
1.3.2血清学方法 (4)
1.3.3分子生物学方法 (5)
1.4卵黄抗体研究进展 (6)
1.4.1卵黄抗体的形成及结构 (6)
1.4.2卵黄抗体的理化性质 (7)
1.4.3卵黄抗体的提取方法 (7)
1.4.4卵黄抗体的应用 (7)
1.5研究目的及意义 (8)
2.材料和方法 (9)
2.1材料 (9)
2.1.1病料来源 (9)
2.1.2试验动物来源 (9)
2.1.3病毒株 (9)
2.1.4主要仪器及设备 (9)
2.1.6主要溶液及培养基的配制 (11)
2.2方法 (12)
2.2.1新型鹅星状病毒的分离与鉴定 (12)
2.2.2新型鹅星状病毒灭活疫苗制备 (17)
2.2.3卵黄抗体的制备 (20)
3.结果 (24)
3.1新型鹅星状病毒的分离鉴定 (24)
3.1.1病毒分离 (24)
3.1.2RT-PCR检测结果 (24)
3.1.3测序结果分析 (25)
3.1.4分离毒株纯净性检测 (27)
3.1.5病毒细胞半数感染量（TCID50）测定 (27)
3.1.6动物回归试验 (28)
3.2新型鹅星状病毒灭活疫苗的制备 (29)
3.2.1抗原液最佳灭活条件优化 (29)
3.2.2灭活疫苗物理性状检验 (30)
3.2.3.3粘度检验 (31)
3.3卵黄抗体的制备 (32)
3.3.1蛋鸡免疫结果 (32)
3.3.2卵黄抗体性状检测结果 (33)
3.3.3注射后抗体水平消长规律 (35)
3.3.4雏鹅预防保护效果 (35)
3.3.5雏鹅攻毒治疗试验结果 (36)
4.讨论 (39)
4.1新型鹅星状病毒的分离鉴定 (39)
4.2灭活疫苗的制备 (39)
4.4卵黄抗体效力检验 (40)
5.结论 (42)
参考文献 (43)
致谢 (52)
山东农业大学硕士专业学位论文
中文摘要
自2017年2月以来，在我国山东、江苏等地的雏鹅暴发了以痛风为主要特征的急性传染病，给我国养鹅业带来巨大的经济损失，病原分离鉴定结果表明导致该病发生的病原为新型鹅星状病毒。

该病主要侵害20日龄以内雏鹅，死亡率可以达到50%以上。

患病雏鹅主要以内脏器官及关节腔发生严重尿酸盐沉积为病理特征。

发病雏鹅精神不振、卧地倦动、采食困难、生长迟缓，料肉比升高，肉鹅出栏合格率显著降低。

卵黄抗体是鸡卵黄中的一种免疫球蛋白，特指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。

与血清抗体相比，卵黄抗体具有良好的稳定性、耐热性、耐酸性，在常温下仍能保持一定的活性。

卵黄抗体安全、高效、无残留且温和环保，治疗效果明显，特异性强，可适合大规模生产。

本研究从临床疑似患病样品中分离出7株新型鹅星状病毒，对分离株进行鉴定分析，选取优势毒株制备油乳剂灭活疫苗，免疫蛋鸡制备卵黄抗体，并进行临床应用研究，旨在为新型鹅星状病毒的预防与治疗提供技术支持。

1.新型鹅星状病毒的分离与鉴定
对本实验室2019~2020年采集的部分疑似感染样品进行新型鹅星状病毒的分离与鉴定，并对分离株进行动物回归试验。

结果，共分离得到7株新型鹅星状病毒分离株，7株病毒核苷酸同源性在96.1%~99.9%之间。

分离株测序分析结果显示，与经典毒株SDPY株核苷酸同源性在96.4%~99.0%之间，并在遗传进化树的同一分支上，表明分离毒株未发生明显变异。

分离株与经典火鸡源、鸭源、鸡源星状病毒处于不同分支，亲缘关系较远。

分离株JLCC株与SDPY株亲缘关系较近，根据其致病性及免疫原性分析，筛选出JLCC株作为疫苗株并进行动物回归试验。

1日龄雏鹅静脉注射1.0mL （TCID50=10-3.22/0.1mL）病毒液后，雏鹅出现精神沉郁，卧地倦动、采食下降等临床症状，死亡雏鹅心脏、肝脏表面有尿酸盐附着、沉积，肾脏肿大、出血呈花斑状，输尿管有尿酸盐沉积等病理变化。

2.新型鹅星状病毒灭活疫苗的制备
将JLCC株接种鸡胚肝脏细胞扩增病毒。

将抗原液经甲醛灭活（期间每隔6~8h摇匀一次）后，与吐温-80按96:4的比例混合制备为水相，将油相与水相按比例乳化，制备新型鹅星状病毒油乳剂灭活疫苗，并检验疫苗的物理性状。

结果表明抗原液最佳灭活条件为终浓度为1.0‰的甲醛37°C灭活24h，理化性状检验结果表明，该疫苗为油包水
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型，离心稳定性良好，未见细菌、霉菌及支原体等微生物污染。

3.新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备
使用制备的油乳剂灭活疫苗免疫蛋鸡，第四次免疫后14d收集高免蛋，使用间接ELISA方法检测卵黄抗体效价并制备提取卵黄抗体。

对提取的卵黄抗体进行物理性状检验、安全性检验、雏鹅预防保护效果检验以及评估雏鹅攻毒后治疗效果。

结果表明，在第四次免疫蛋鸡后，卵黄抗体效价为1:1024，提纯后卵黄抗体效价为1:512，理化性质及安全性检验结果显示，该抗体为淡黄色澄清透明液体，久置含有少量白色沉淀，未见细菌及支原体等微生物污染。

抗体安全性良好，1日龄雏鹅颈部皮下注射1.0mL，未出现局部红肿和全身性不良反应。

ELISA检测结果表明，当雏鹅体内抗体OD450值达到0.8及以上时，即可对新型鹅星状病毒的感染起到有效的预防作用。

1日龄抗体注射后，雏鹅特异性抗体在1dpi开始上升，在注射后3d达到峰值之后开始下降，但依然维持较高水平。

同时对雏鹅进行攻毒治疗试验，结果表明：在雏鹅自然带毒情况下，于1日龄和7日龄分别注射一次卵黄抗体，雏鹅的排毒期最短、生存率高、体重增长速度快，治疗效果最好。

综上所述，本研究制备的新型鹅星状病毒卵黄抗体具有良好的免疫保护效果，且对带毒雏鹅具有较好的治疗效果，能够对N-GAstV的感染起到预防和治疗作用，为我国新型鹅星状病毒的预防与治疗提供一种快速、有效的新型生物制品，为雏鹅痛风病的综合防控提供技术支持。

关键词：新型鹅星状病毒；分离鉴定；卵黄抗体；灭活疫苗
山东农业大学硕士专业学位论文
Abstract
An outbreak of acute infection with gout as the main feature in goslings in Shandong and Jiangsu in China since February2017,and it has brought huge economic losses to the goose industry,the isolation and identification of the causative agent of the disease indicates that it is a novel goose astrovirus.The disease mainly affects goslings within2weeks of age.The affected goslings are pathological characterized mainly by severe urate deposition on the internal organ surface and joint cavity,with mortality rate reaching more than50%.The affected goslings are not in good spirits,lying on the ground and moving,difficulty in feeding, slow growth,increased meat ratio,and significantly reduced the rate of meat goose slaughter.Yolk antibodies are a type of Immunoglobulin found in chicken egg yolk,it refers specifically to antibodies against specific antigens extracted from immunised poultry eggs. Compared to serum antibodies,yolk antibodies are more stable,heat and acid resistant and remain active at room temperature.The yolk antibody is safe,efficient,residue-free and environmentally friendly,with a significant therapeutic effect,high specificity and can be suitable for mass production.
In the study,N-GAstV was isolated from samples of clinically probable disease,the isolates were identified and analysed,the dominant strain was selected to prepare an inactivated vaccine in oil emulsion,immunised laying hens to produce yolk antibodies,and clinical application studies were conducted with the aim of providing technical support for the prevention and treatment of the new goose stellate virus.
1.Isolation and identification of a Novel Goose Astrovirus.
Isolation and identification of novel goose stellate virus from some of the suspected infected samples collected in our laboratory from2019to2020,and animal regression experiments on the isolated strains.The results showed that seven novel goose astrovirus was isolated.The nucleotide homology of the seven viruses ranged from96.1%to99.9%. Homology analysis of the isolate with N-GAstV showed that it has between96.4%and99.0% nucleotide homology with the classic strain SDPY,indicating a relatively high level of homology,and on the same branch of the genetic evolutionary tree.The isolates are in different branches from the classical turkey,duck and chicken origin astroviruses and are more distantly related.The isolated JLCC strain was the closest relative to the SDPY strain and was selected as the vaccine strain for animal regression experiments based on its pathogenicity and immunogenicity analysis.After1.0mL(TCID50=10-3.22/0.1mL)of viral solution was administered intravenously to1-day-old fledgling geese,the goslings showed
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clinical signs such as depression,lying down and moving around,and reduced feeding. Through autopsy,it was found that there were pathological changes such as urate adherence and deposition on the heart,liver surface and inner thigh muscles of the dead geese,swollen and bleeding kidneys in the form of flecks,thickened ureters and urate deposition.
2.Preparation of a novel goose astrovirus oil emulsion inactivated vaccine.
The vaccine strain was inoculated with chicken embryo liver cells for amplification.The antigen liquid was inactivated by formaldehyde(shaken every6-8hours)and mixed with Tween-80at a ratio of96:4to produce an aqueous phase,and the oil phase was emulsified with the water phase at2:1to prepare a novel goose astrovirus oil emulsion inactivated vaccine,and the physical properties of the vaccine were checked.The results showed that the best inactivation conditions for the antigen were formaldehyde at a final concentration of 1.0‰and kept at37°C for24hours.The physical and chemical properties of the vaccine showed that it was a water-in-oil type with good centrifugal stability and no microbial contamination such as bacteria and mycoplasma.
3.Preparation of yolk antibodies to a novel goose astrovirus.
Inactivated oil emulsion vaccine used to immunise laying hens.Highly vaccinated eggs were collected14d after the fourth immunisation.The potency of the yolk antibodies was checked using an iELISA method and the extracted yolk antibodies were prepared.The extracted yolk antibodies were evaluated for physical property test,safety test,chick protection effect test and chick treatment effect after attacking the poison.The results showed that after the fourth immunization of the hens,the potency of the in-yolk antibody was1:1024 and the potency of the prepared yolk antibody solution was1:512.The physical and chemical properties of the antibody showed that it was a pale yellow clear liquid containing a small amount of white precipitate over a long period of time,with no microbial contamination such as bacteria or mycoplasma.The safety of the antibody is good.1.0mL was injected subcutaneously into the neck of1day old goslings and no local or systemic adverse reactions were observed.The iELISA results show that the novel goose astrovirus can be effectively prevented when the OD450value comes to the0.8.Antibody monitoring results show that chick-specific antibodies begin to rise at1dpi,reach a maximum at3days of age and then begin to decline,but can still be kept at a high level.The results of the chick attack treatment trials have shown that,in the case of naturally poisoned geese,the shortest detoxification time, high survival rate,rapid weight gain and the best treatment effect were achieved by injecting the yolk antibody once at1day of age and once at7days of age respectively.
山东农业大学硕士专业学位论文
In summary,the novel goose astrovirus yolk antibody prepared has good immunoprotective effect in this study,and it has a good effect on the treatment of affected goslings and can be used as a preventive and treatment against N-GAstV.It provides a rapid and effective novel biological product for the prevention and treatment of novel goose astrovirus in China,and provides technical support for the comprehensive prevention and control of gout disease in goslings.
Key words:Novel Goose Astrovirus;Isolation and Identification;Yolk Antibodies;
Inactivated Vaccine.
1.前言
星状病毒为人兽共患病病原体。

人星状病毒可以引起婴幼儿腹泻及老年人急性病毒性肠炎；1~56日龄仔猪感染星状病毒后主要表现为糊状腹泻；雏鸭感染鸭星状病毒后表现为严重的角弓反张，病理变化主要为肝炎特征，肝脏出血，肾脏肿大；新型鹅星状病毒能够引起雏鹅痛风，以内脏器官及关节腔发生严重尿酸盐沉积为病理特征，发病雏鹅精神不振、卧地倦动、采食困难、生长迟缓，料肉比升高，肉鹅出栏合格率显著降低。

因此，预防和防治新型鹅星状病毒引起的雏鹅痛风病具有重要意义。

1.1病原学
1.1.1星状病毒的分类
星状病毒（Astroviruses,AstV）是一种呈球形的RNA病毒，直径为25~35nm，病毒表面无囊膜，有5~6个突起，用透射电子显微镜（TEM）观察到的病毒呈五角星状或六角星状，故称为星状病毒。

1975年，Kakizawa等首次在具有腹泻和呕吐症状儿童的粪便样本中用电子显微镜观察到星状病毒（Kakizawa et al.,2013），此后调查发现，其他哺乳动物也可以感染星状病毒，并可以引起宿主从无症状到全身症状的疾病（Wohlgemuth et al.,2019;Spinato et al.,2017;Sajewicz et al.,2016）。

与哺乳动物一样，大多数禽类也容易感染星状病毒，并出现不同的临床症状（Baxendale et al., 2004;Behlingkelly et al.,2002;Chen et al.,2012）等。

国际病毒分类委员会将星状病毒科（Astroviridae）划分成两个不同的病毒属：哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）和禽星状病毒属（Avastrovirus）（King et al.,2011）。

其中禽星状病毒属有3个成员，分别为Avastrovirus1（AAstV-1）、Avastrovirus2（AAst V-2）和Avastrovirus3（AAst V-3）（King et al.,2011）。

到目前为止，确定易受星状病毒感染的动物范围涉及陆生、水生、家养及野生等多种禽类和哺乳动物。

1.1.2病毒基因组及主要蛋白
星状病毒的基因组全长6.5~7.9kb，包括一个5'非翻译区（UTR），三个开放阅读
框（ORF），即ORF1a，ORF1b和ORF2，一个3'UTR和一个poly-A尾巴。

病毒基因组编码三种蛋白质，包括非结构蛋白，RNA依赖性RNA聚合酶和衣壳蛋白（Monroe et al.,1993）。

ORF1a全长2.8kb，编码110kDa多肽。

该多肽含有多种保守基序，包括几个可能的跨膜螺旋、盘绕结构域、一个免疫活性表位、可能的核定位信号和丝氨酸蛋白酶。

翻译的多肽被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶同时切割成至少五个肽。

ORF1b编码病毒依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp），该区域与ORF1a重叠约70个核苷酸，但研究发现ORF1b 的5＇端缺乏合适的起始密码子AUG（Monroe S S et al.,1991）。

ORF2则编码病毒衣壳结构蛋白（何国芳,2004）。

病毒复制过程中，在感染的细胞中可以检测到两种病毒特异性RNA：一个是全长为6.8kb的基因组RNA，另一个是全长为2.8kb的亚基因组RNA。

其中含有完整ORF2序列的亚基因组RNA可以作为表达衣壳蛋白的m RNA。

ORF2编码产物至少包括两个区域：第一个区域从第1个氨基酸开始至第415个氨基酸结束，为各个血清型之间的高度保守区域；第二个区域从第416个氨基酸开始至最后一个氨基酸结束，为各个血清型之间高度变异区域，在此区域内包含抗原中和决定簇。

图1星状病毒基因组结构图
Figure1Genome structure of Astrovirus
星状病毒为RNA病毒容易发生基因重组和基因突变，在禽类和哺乳动物类星状病毒中均发现了变异毒株。

Van和Lukashov（Van et al.,2007；Lukashov et al.,2002）在研究中发现星状病毒为了抵抗环境的变化以及宿主免疫系统的影响，会在衣壳蛋白的抗原表位或者宿主细胞的作用点发生选择性突变，这也从侧面反映出星状病毒ORF2基因的高度变异性。

星状病毒存在基因重组现象。

Walter（Walter et al.,2001）等在2001年发现一株新型HAstV，该毒株ORF1b区域来自于HAstV-3，ORF2区域来自于HAstV-5,该毒株广泛分布在不同地区；Wolfaardt（Wolfaardt et al.,2011）等学者发现一株星状病毒，其部分
ORF1a序列来自HAstV-6和HAstV-7，而部分ORF1b序列来自HAstV-3，ORF2序列来自于HAstV-2；同时有报道称牛星状病毒与鹿星状病毒发生过重组现象（Herman Tse et al., 2011）；火鸡星状病毒也发生过重组现象（Strain,E et al.,2008;Pantin-Jackwood et al.,2006）。

1.1.3培养特性
包括火鸡源星状病毒和鸡源星状病毒在内的大多数禽类星状病毒，都已能够成功利用胚胎进行病毒分离。

火鸡源星状病毒可以在火鸡胚胎的卵黄囊中复制增殖，也可以通过羊膜途径接种火鸡胚胎。

鸡星状病毒接种卵黄囊后，可在7日龄或14日龄SPF雏鸡胚胎中复制增殖。

感染可能不会导致14日龄的胚胎出现死亡、矮化和水肿的现象，对7日龄的胚胎也不会出现各种影响。

研究者通过细胞培养分离TAstV一直未取得成功，但已有报道称在原代鸡胚肝脏细胞中成功分离和增殖CAstV，并在4~5代后产生明显的细胞病变效应。

鸡星状病毒最初在鸡胚成纤维细胞和鸡肾细胞中复制较差，但经过多次传代后会在鸡肾细胞中复制并诱发CPE。

田家军（田家军，2019）利用鹅胚及鹅胚肾细胞成功分离出N-GAstV。

1.1.4理化性质
星状病毒性质稳定，在60°C环境中能耐受10min。

星状病毒无囊膜，因此能抵抗酚类、酸类及大多数醇和脂类溶剂的灭活，氯仿、各种洗涤剂、常温、季氨等也无法使其灭活。

在4°C条件下星状病毒可以稳定存活数周。

研究表明，为达到灭活AstV的目的，可以选择90％甲醇或含有过硫酸盐的消毒剂为灭活剂（Schultz,2001;Nolan,2016）。

1.2流行病学及病理变化
雏鹅感染新型鹅星状病毒后临床特征主要表现为痛风。

5~20日龄雏鹅最易感，死亡率高达50%。

该病主要传播途径为消化道和呼吸道（徐丽娜，2020）。

病毒在死亡雏鹅的肾脏、心脏、大脑、肝脏以及脾脏等器官检测均为阳性，证明该病毒具有广泛的组织嗜性（Smyth et al.,2012）。

该病主要特征为发病雏鹅内脏器官和关节腔有大量尿酸盐沉积，雏鹅发病最早为1日龄，主要表现为精神不振、行走困难、采食下降、排混有灰白色尿酸盐的稀便。

剖检可见死亡雏鹅肾脏、心脏、肝脏、脾脏及关节腔等主要器官有大量尿酸盐沉积，肾脏出
现出血、肿大等临床症状（姜晓宁，2018）。

病理变化表现为肾小管上皮细胞脱落、坏死、管腔内有尿酸盐沉积，脾脏淋巴细胞坏死并减少，肝细胞发生空泡变性并伴有尿酸盐沉积（田家军，2019）。

1.3诊断方法
目前对新型鹅星状病毒的检测方法主要有电镜法、血清学方法和分子生物学方法。

1.3.1电镜法
电镜法是利用电子显微镜对病毒粒子显微结构进行观察的一种检测方法（Appleton et al.,1975）。

星状病毒因其具有特别的五角或六角星外观，所以电镜法是早期检测星状病毒的主要手段（Madeley et al.,1975;于维军，1992）。

然而，在人群中只有10%的AstV 可能表现出这种形态，而可视化依赖于样本制备因此使用电子显微镜检测病毒拥有局限性。

同时有些微RNA病毒的大小与星状病毒相似，特别是有些星状病毒缺乏特殊的五角或六角星外观，因此利用电子显微镜直接观察缺乏准确性（Haider,1979），且电子显微镜只能对单一样品观察，不适合大量样本的检测。

1.3.2血清学方法
Lee等报道在体外利用细胞扩增星状病毒时，加入适量的胰酶有利于星状病毒的生长增殖，可用于制备不同血清型的单克隆和多克隆抗体（庄金秋,2015），促进了星状病毒血清学检测方法的发展。

酶联免疫吸附试验（ELISA）是实验室最常用的血清学检测方法，其具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强的特点。

间接ELISA方法是先将已知抗原吸附在固相载体上，然后加入待检血清，如有相应抗体，则与在载体表面上的抗原形成复合物，冲洗后，再加入酶标记的抗球蛋白抗体与之反应，冲洗后，加底物显色，产生的有色产物的量与待测抗体的含量成正比。

然后用酶标分光光度计测定。

荷兰Bio Chek公司已研制出检测CAstV-B抗体的ELISA试剂盒，应用于临床上对鸡星状病毒抗体的大规模检测（Van et al.,2017）。

本实验室已成功表达ORF1b蛋白，并建立了新型鹅星状病毒间接ELISA方法，可用于临床上对大量样本的检测。

1.3.3分子生物学方法
1.3.3.1核酸杂交技术
核酸杂交技术的理论基础是在一定条件下两条互补的多聚核苷酸链能够形成稳定的杂交体。

在杂交时，用一种预先分离纯化的已知单链DNA或RNA序列片段去检测未知的核酸样品。

被标记的已知DNA或RNA序列片段，称之为核酸探针。

探针方法具有高度的敏感性、特异性及可重复性，因而在禽病诊断中广泛应用。

目前已经报道了包括NDV、MDV、IBV、REV等多个病毒和细菌的探针检测方法。

Behling-kelly（Behling-kelly et al.,2002）等人将该技术应用于感染火鸡绒毛肠细胞中TAstV-2病毒的检测，不仅实现了对病毒的快速检测，同时也能够对病毒的感染部位准确定位。

1.3.3.2PCR技术
PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，具有敏感性高、特异性强、快速简便等特点。

PCR对于RNA或DNA的质量要求不高，任何新鲜或陈旧组织、细胞、体液均可通过PCR检测，因此该技术已广泛应用于疫病的检测、诊断和流行病学的监测。

目前该技术已成为临床上检测AstV的主要手段。

Mandoki等针对不同AstV 建立了RT-PCR和荧光定量PCR诊断技术（Mandoki et al.,2006），为AstV的检测和病原的监测提供了技术手段。

Koci（Koci et al.,2000）等人最早将RT-PCR的方法应用于火鸡星状病毒的检测，随后RT-PCR被广泛应用于ANV、CAstV、DAstV、及TAstV等病毒的检测。

1.3.3.3实时定量PCR
实时定量PCR重大的突破在于实现了PCR反应由定性判定到定量分析的跨越，在整个反应的过程中极大程度杜绝了污染。

实时定量PCR技术分为依靠双链DNA特异性荧光染料的染料法和依赖荧光标记探针的探针法。

实时定量PCR技术具有准确性高、特异性好、灵敏度高、线性范围广、操作安全、简单、自动化程度高等特点，检测和扩增可在同一管中进行，无需开盖，不易污染，并且扩增和检测同时完成。

田家军（田家军，2019）通过比对新型鹅星状病毒ORF2基因，设计了1对引物及１条特异性Taq Man探针，使其具有新型鹅星状病毒的通用性，建立的Taq Man探针荧光定量PCR检测方法，具有灵敏度高，特异性强，重复性好的特点，可在鹅群感染
早期或病毒滴度较低时，检测到病毒的存在，为该病的早期诊断提供检测依据。

1.3.3.4环介导等温核酸扩增技术（LAMP）
Notomi等（Notomi et al.,2000）于2000年首次报道环介导等温核酸扩增技术。

该技术可用于检测动物、植物和人类等样品中的病原体。

LAMP是一种等温核酸扩增方法，一般采用一组4种或6种不同的引物，它们特异性地与分子靶标上的互补序列结合。

LAMP检测的引物组包括前向外引物（F3）、后向外引物（B3）、前向内引物(FIP)、后向内引物(BIP)，以及另外两个加速扩增引物，包括正向循环引物（LF）和后向循环引物（LB）。

有了引物，LAMP检测不需要特殊的仪器和设备，水浴锅或加热块即可进行等温加热。

LAMP技术耗时短、检测限低，有较高的敏感性和特异性，在1h内便可将目的片段大量扩增，且结果肉眼即可观察。

He Dalin（He Dalin et al.,2020）等根据新型鹅星状病毒ORF1a基因设计了2条内引物和2条外引物，可在65℃水浴中或在实时PCR仪上于60min内完成定量分析。

He Dalin等建立的qLAMP检测方法灵敏度高，检测极限为10拷贝的目的DNA/μL，与其他病毒无交叉反应，重复性好，变异系数为0.61%~2.21%。

结果表明，N-GAstV的qLAMP检测方法简便、准确、快速、灵敏、特异，适用于临床检测。

1.4卵黄抗体研究进展
卵黄抗体（IgY）是鸡卵黄中的一种免疫球蛋白，属γ球蛋白，其最早开始于19世纪末德国莱比锡医生F.Klemperer的经典试验，即经过免疫的母鸡所产鸡蛋的蛋黄中存在具有能对免疫原产生特异性中和的活性蛋白，该蛋白即为卵黄抗体（曹思婷等，2018）。

卵黄抗体与哺乳动物血清免疫球蛋白相比，在生产效率、动物福利和特异性方面具有一定的优势。

家禽血液中的主要免疫球蛋白被传递给后代，并在卵黄中积累，这使得非侵入性地获取大量抗体成为可能。

此外，由于结构上的差异，IgY比哺乳动物抗体更适合于诊断，因为它不与人类免疫系统的某些成分发生反应，并且对哺乳动物保守蛋白表现出更强的亲和力。

卵黄抗体（IgY）作为治疗和诊断的工具，在健康研究中得到了广泛的应用。

1.4.1卵黄抗体的形成及结构
Ig Y是禽类主要的血清抗体经母体血液循环特异性聚集到卵黄中，由此得名卵黄抗
体。

IgY分子具有与IgG相似的结构，有两条重链（H）和两条轻链（L），每条重链的分子量为67~70kDa，轻链的分子量为25kDa。

轻链有一个恒定区（CL）和一个可变区（VL），与IgG相似。

IgY和IgG的主要区别在于重链。

IgG在重链上有三个恒定区（CH1-CH3），而IgY有四个恒定区（CH1-CH4）。

另一个恒定结构域，带有相应的碳水化合物链，使IgY比IgG（150KDa）有更高的分子量（180KDa）。

1.4.2卵黄抗体的理化性质
因为Ig Y的恒定区比IgG多一个，所以IgY比IgG稳定性更强，在耐酸、耐碱、耐高低温等方面比Ig G更具有优势。

当pH值为 4.0～11.0时Ig Y较稳定，在当pH值＜4或＞12时IgY会失去活性。

当温度在60～70°C时，IgY仍然稳定，在65°C时，其活性可保持24h以上，当温度达到70°C时活性可以保持90min，因此可以采用巴氏消毒法对IgY进行灭菌处理。

IgY在室温下保存时间可达到180d左右，在4°C下可保存6～7年，但其活性会下降5%左右。

（曹思婷等，2018）。

1.4.3卵黄抗体的提取方法
禽卵黄中含有大量的蛋白质和脂质，直接注射动物会引起机体出血、肿胀甚至坏死。

因此，需要将卵黄中的抗体与磷脂等大分子分离、提纯，以便于保存和应用。

近年来人们已经建立了多种提取卵黄抗体的方法。

吴博等（吴博等，2012）比较了水稀释法、辛酸法、海藻酸钠法、酚沉淀法、乙酸-乙酸钠法，实验结果表明辛酸法回收率最高，且蛋白质浓度最高。

辛酸法和海藻酸钠法提取的卵黄抗体凝集效价最高，因此辛酸法较其他4种方法相比提取效率最高。

向冬梅等（向冬梅等，2020）对氯仿法、硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、水稀释法、辛酸法等方法的实验条件进行优化处理，结果显示聚乙二醇沉淀法经过改良提取效率高、操作简单、拥有很高的卵黄抗体纯度及抗体效价，适合工业生产。

1.4.4卵黄抗体的应用
卵黄抗体可以作为饲料添加剂对动物提供保护作用，并能够提供营养物质，同时促进动物生长发育。

在饲料中添加卵黄抗体，可以预防细菌、病毒、寄生虫性疾病（亓秀晔等，2017）。