纳米磁性微球免疫伏安法测定乙肝表面抗原

2004年第62卷
第24期，2447~2450
化学学报
ACTA CHIMICA SINICA
Voi.62，2004
No.24，2447~2450
·研究简报·
纳米磁性微球免疫伏安法测定乙肝表面抗原
程琼a，6彭图治!，a刘爱丽a
（a浙江大学化学系西溪校区杭州310028）
（6嘉兴学院生物与化工学院嘉兴314001）
摘要采用化学键合法将乙肝抗体固化在自行制备的纳米磁性高分子功能微球表面，利用免疫夹心反应原理，捕获溶液中的乙肝表面抗原和标记有辣根过氧化物酶的乙肝第二抗体.在外加磁场的作用下，抗体抗原结合物从样品溶液中分离，在含有邻氨基苯酚和过氧化氢的底液中，生成具有电活性的化合物3-氨基吩呃嗪，用示差脉冲伏安法进行测定.响应电流与乙肝表面抗原浓度分别在0.2~1.0和1.0~500ng·mL-1成线性关系，检出限达0.060ng·mL-1.采用本方法检测血清中乙肝表面抗原，灵敏度大大高于目前临床采用的酶联免疫吸附法.
关键词纳米磁性功能微球，乙肝表面抗原，免疫分析，电化学检测
Detection of Hepatitis B Surface Antigen Using Immunovoltammetry
with Nano-magnetic microsphere
CHENG，Oiong a，6PENG，Tu-zhi!，a LIU，Ai-Li a
（a Department of Chemistry，Xixi Campus，Zhejiang Uniuersity，Hangzhou310028）
（6College of Biological and Chemical Engineering，Jiaxing College，Jiaxing314001）
Abstract A novei method for detecting hepatitis B surface antigen（HBsAg）using nano-magnetic poiymer carboxyi microsphere was reported.The surface of the nano-magnetic poiymer carboxyi microsphere covaientiy bound with hepatitis B surface antibody（HBsAb），and then captured HBsAg and hepatitis B secondary antibody iabeied with horseradish peroxide enzyme.The microsphere with sandwich compiex was separated magneticaiiy from sampie soiution and the enzyme iabeied at the compiex cataiyzed the reaction of2-aminohydroxybenzene and hydrogen peroxide in the buffer soiution.The eiectroactive product2-hydroxy-3-aminophenoxazine was detected using differentiai puise voitammetry.The peak current was iinear with the concentration of HBsAg in the range of0.2~1.0and1.0~500ng ·mL-1respectiveiy.The detection iimit was found to be0.06ng·mL-1.The method has been used to detect the concentration of hepatitis B virus in human serum and the sensitivity was much higher than that of enzyme-iinked immunosorbent assay（ELISA）used in diagnostic anaiysis.
Keywords nano-magnetic functionai microsphere，hepatitis B surface antigen，immunoassay，eiectrochemicai detection
磁性高分子功能微球是指通过共聚和表面改性的方法，使有机高分子与无机磁性物质结合起来形成的微球，它既具有磁性又具有表面官能基团（如—OH，—COOH，—CHO，—NH
2
等）.通过化学键合方法，可使其表面接上生物活性物质，并保持生物活性.磁性微球作为一种高效、简便的生化分离技术，尤其在肿瘤细胞［1］和微生物菌种［2~5］的分离过程中所表现出来的重要作用，受到医学、分子生物学等领域的高度重视.近年来，纳米技术逐步进入分析化学领域，由于纳米磁性微球易于分离并具有极大的比表面积，为修饰多种高密度探针分子提供了基础，大大改善了分析测试的选择性和灵敏度，正迅速发展为现代分析和分离的重要方法之一［6~9］.
"
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乙型肝炎是一种危害性极大的传染病，并可能进一步发
!E-maii：tzp@；Tei：*************；Fax：*************.
Received May25，2004；revised and accepted August24，2004.
国家自然科学基金（Nos.29975024，20275034）与浙江省重点科技计划（No.2003C21024）资助项目.
展为肝硬化和肝癌，目前在人群中有蔓延扩散的趋势，早期在血清中诊断出乙肝表面抗原对诊断乙型肝炎有重要意义.目前，诊断乙肝抗原的新方法已有报道，如用表面等离子体子共振生物传感器用于测定乙肝表面抗原，其特点是抗体上无需标记而且灵敏度高［10］.传统的方法有酶联免疫吸附法（ELISA）和放射免疫法（RIA），RIA法由于需用放射性物质标记抗体，其废物难于处理，已很少使用.而目前最常用的ELISA法是将抗体吸附包被在聚乙烯板上，但结合的探针量有限，灵敏度不高.为了寻求灵敏而简便的临床检测新方法，本文提出以纳米磁性功能微球捕获乙肝抗原，再以灵敏的电化学方法进行检测.由于采用纳米级羧基磁性微球，以化学键合方式包被乙肝抗体，抗体固化量增大，和抗原接触面增大，反应速度加快.当磁性微球结合抗原和酶标抗体后，加入底物，以示差脉冲伏安法检测所产生的电活性物质.由于结合了纳米磁球技术和电化学方法的优点，本方法不仅简便省时，而且灵敏度明显高于传统的ELISA法.
!实验部分
!.!仪器和试剂
PPMS-9物理特性测试仪（美国Ouantum DeSign公司）；JEM-2010（HR）透射电镜（日本NEC公司）；S-570扫描电镜（日本日立公司）；CHI-440电化学工作站（美国CHI公司）；E-200荧光显微镜（日本尼康公司）；G-560E震荡器；金电极为石英玻片上光刻镀金；Teflon反应池；自制磁力架.纯化的HBSAD单克隆抗体溶液（浓度为5.2mg·mL-1）；纯化的HBSAD多克隆HRP酶标抗体溶液（浓度为4.7mg·mL-1）；HBSAg抗原溶液（浓度为5mg·mL-1）；酶稀释液；以上试剂由杭州埃夫朗生物制品公司提供.HBSAg质控血清由卫生部临床检测中心提供（浓度为0.5ng·mL-1，批号为0208；1ng·mL-1，批号为0207；2ng·mL-1，批号为0207；5ng·mL-1，批号为0301）.盐酸-1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、!-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、牛血清白蛋白、三羟甲基氨基甲烷购自Sigma公司.其它试剂为国产分析纯，实验用水均为二次重蒸水.
!."实验方法
1.2.1超顺磁性纳米磁性微球的制备
用化学沉降法［11］制备Fe
3
04磁性超细颗粒磁流体，颗粒大小经透射电镜证实为8~10nm.将3mL磁流体，7g聚乙二醇，60mL乙醇和15mL水加入三颈烧瓶中，超声波分散10min，在氮气保护下加入20mL苯乙烯，2mL丙烯酸，0.8 mL二乙烯基苯和3g过氧化苯甲酰.温度控制在75C，在一定转速下，聚合反应101，用重蒸水和乙醇反复浸洗，磁性分离，得到棕黄色的磁性羧基微球［12］.
1.2.2乙肝抗体的固定
取20!L20g·L-1羧基磁性微球，加入1.0X10-3mol·L-1新配制的EDC［13］和NHS溶液各500!L，室温下在震荡器上震荡15min，磁分离，用pH7.2磷酸缓冲液震荡清洗已活
化的磁性微球，加入50!L新配的乙肝抗体溶液（稀释比为111000），震荡反应21，磁分离，用0.1mol·L-1TriS-HCl-0.05%Tween20洗涤，磁分离，重复操作三次，用1%牛血清白蛋白（BSA）溶液振荡封闭241，防止游离抗原和抗体的非特异性吸附.
1.2.3免疫磁性微球捕获抗原和酶标抗体
封闭后的免疫磁性微球，磁分离去除BSA溶液，加入50 !L抗原和50!L酶标抗体溶液（稀释比为112000），在37C 恒温下，振荡反应10min，磁分离，用0.1mol·L-1TriS-HCl-
0.05%Tween20洗涤，磁分离，再用重蒸水洗涤，磁分离.
1.2.4电化学检测
在反应后的磁性微球中，加入新配的0.1mL1.0X10-2 mol·L-1邻氨基酚，0.5mL4.0X10-3mol·L-1过氧化氢和0.5 mL0.1mol·L-1pH=7.2的磷酸缓冲液，在37C恒温水浴中反应30min，取出后，立即转移到Telfon池中，用示差脉冲伏安法（DPV）检测其电流值，扫描速率为50mV·S-1，扫描范围：-0.50~0V.金膜电极使用前用新配的H
2
S04130%H202（311）溶液浸泡，丙酮和蒸馏水超声清洗，干燥后备用［14］. "结果和讨论
".!磁性微球特性的表征
取磁性微球粉末在物理特性测试仪上测定，其饱和磁距为1.26emu·g-1，剩磁小于0.1%，表明纳米磁性微球无剩磁和磁滞现象［15］，表现为超顺磁性，便于磁性微球和底液分离后重新分散用于分析检测.将自行制备得到的表面连有羧基的磁性微球，置于扫描电镜下观察，其粒径大小为90~100 nm.
为了考察抗体包被状况，采用荧光显微镜直接观察大粒径磁性微球与含有荧光标记物抗体的结合过程.将磁性微球用浓度各为1.0X10-3mol·L-1EDC和NHS偶联试剂活化表面的羧基，洗涤，磁分离，再将浓度为5.0X10-3mg·mL-1荧光标记抗体加入到微球中，取不同时间段反应的微球，磁分离，除去未结合的荧光标记物，将微球置于荧光显微镜下观察.实验发现，反应时间少于11，在荧光显微镜下观察，未有荧光小球出现，反应11后，有弱荧光小球出现.随着反应时间的增加，荧光强度逐渐增强，反应21后，强荧光小球出现，再延长反应时间，荧光强度不再增强.说明荧光强度趋于饱和，抗体已通过化学键合法连结到磁性微球表面，反应时间仅需21，而ELISA方法用板式吸附包被抗体需241.因此，用化学键合法包被抗体，不仅缩短了反应时间，而且给免疫反应预留了更多的空间，有更高的稳定性和更好的特异性［16］.在后面的实验中，包被抗体时间均为21.
"."电化学检测
2.2.1免疫磁性微球催化底物在金膜电极上的电化学行为
磁性微球作为免疫反应的载体，包被抗体后，利用免疫反应的专一性，与被测抗原和酶标抗体反应，在磁性微球表
8442化学学报Vol.62，2004
面形成“三明治”类复合物，未反应的抗原和酶标抗体游离在溶液中，在磁力架上很容易被分离.由于磁性微球的大小为纳米级，极大地增大了反应的有效表面积，增加了抗体固化量，提高了反应的灵敏度.在结合了夹心式复合物的磁性微球中，加入邻氨基酚和过氧化氢后，结合在微球表面的过氧
化物酶催化底物，生成3-氨基吩呃嗪
［l7］，由于3-氨基吩呃嗪是一个强的电活性物，产生的电化学信号用电化学方法进行测定.在以金膜为工作电极的三电极系统中，
进行循环伏安法扫描.实验发现，
在金膜电极表面有灵敏的电化学响应信号（图l ）.从图中可以看出，
邻氨基酚和过氧化氢在过氧化物酶的催化下生成3-氨基吩呃嗪，在p~为7.2的磷酸缓冲液中作循环伏安扫描，3-氨基吩呃嗪在-0.270V 和-0.320
V 处，
出现一对明显的氧化还原峰，此电流信号与抗原浓度成正比.本法克服了常规光度分析法灵敏度低的不足，使测定的灵敏度显著提高
.
图1
催化底物的循环伏安图
抗原浓度：a —0；b —80ng ·mL -l
Figure 1
Cyciic voitammograms of eiectroactive cataiyzed substrate
Concentration of antigen ：a —0；b —80ng ·mL -l
邻氨基酚和过氧化氢在过氧化物酶的催化下生成3-氨
基吩呃嗪，反应机理见图2
：
图23-氨基吩呃嗪的形成及氧化
Figure 2
Formation and oxidation of 2-hydroxy-3-aminophenoxazine
2.2.2酶催化反应中溶液p~值的影响
为了考察溶液p~值对响应电流的影响，配制不同p~
值的溶液分别进行测定，其中p~值为4和5的溶液是醋
酸-醋酸钠缓冲液，p~值为6，7和8的溶液是磷酸缓冲液，p~值为9和l0的溶液是碳酸钠和碳酸氢钠缓冲液.实验发
现，酶促反应在p~值为7时为最大，考虑到测定在中性环境中进行，故选择溶液p~值为7.2的磷酸缓冲液作为反应的
底液.
2.2.3包被抗体数量对响应电流的影响
将不同量的抗体分别加入到磁性微球中，反应2h ，用牛
血清白蛋白封闭，再加入抗原和酶标抗体，反应30min ，磁分离，再加入反应底物，反应30min ，反应产物用示差脉冲伏安
法测定其响应电流.实验发现，当包被量为50!L 时，磁性微球上包被的抗体量达到饱和，响应电流逐渐稳定.
2.2.4免疫磁性微球与抗原和酶标抗体的反应时间对
响应电流的影响
在包被了单克隆抗体的磁性微球中加入抗原和酶标溶液，反应不同的时间，同上操作，测定其响应电流.实验发现，磁性微球均匀地分散在溶液中，增大了接触溶液的表面积，反应l0min 已完成，
而ELISA 方法需要30min.2.2.5线性关系、检测限和变异系数
配制一系列不同浓度的抗原溶液，分别取50!L 抗原溶
液和50!L 酶标溶液在免疫磁性微球中进行反应，磁分离后，加入底物，用示差脉冲伏安法测定其响应电流（图3）.从图中可以看出，峰电流随抗原浓度增加而增高，两者呈线性关系，图中峰电位轻微正移的现象，可能是由于连续测定过程中电极表面吸附微量残留杂质而引起的.实验证明，用本法测得的乙肝表面抗原的浓度范围在0.2~l.0和l.0~500ng ·
mL -l 内，响应电流（扣除空白值）
与抗原浓度分别成线性图3
不同浓度抗原的示差脉冲伏安图
抗原浓度：a —0；b —0.2；c —0.5；d —l.0；e —l0；f —30；g —80
ng ·mL -l
Figure 3Differentiai puise voitammograms of different antigen
concentrations
Concentration of the antigen ：a —0；b —0.2；c —0.5；d —l.0；e —l0；f —30；g —80ng ·mL -l
9
442No.24程琼等：纳米磁性微球免疫伏安法测定乙肝表面抗原
关系，直线回归方程分别为y（!A）=2.474x（ng·mL-1）+ 0.1313，相关系数r=0.9908和y（!A）=0.06218x（ng·mL-1）+3.323，相关系数r=0.9961，根据3倍信噪比进行计算，最低检测限为0.06ng·mL-1.取浓度为10ng·mL-1的6份抗原溶液分别进行测定，所得电流值分别为4.38，4.45，4.04，4.37，4.10，4.32!A，RSD=3.9%，说明本法具有良好的重现性.
2.2.6免疫磁性微球对~BsAg的特异性实验
由于乙肝病人的血清中存在病毒表面抗原（~BsAg）、病毒e抗原（~BeAg）、病毒核心抗原（~BcAg），血清中检出~BsAg颗粒就意味着患者感染了乙型肝炎.而质控血清是通过收集乙肝患者的血清并经处理得到的混合物，它含有~BsAg颗粒和其它脂类、糖类分子等，成分较复杂.纯化的~BsAg溶液是从微生物中提取并经过处理的纯净的~BsAg 溶液，所以必须用~BsAg质控血清与纯化的~BsAg溶液在相同条件下作对照试验，来说明免疫磁性微球对~BsAg的特异性实验.现用~BsAg质控血清0.2，0.5，1.0ng·mL-1分别对其测定三次，电流平均值分别为690，1587，2521nA，与纯化的~BsAg溶液同浓度比较，电流平均值分别为669，1547，2493nA，二者响应值基本一致，说明免疫磁性微球对~BsAg测定有很好的特异性.
2.2.7实际样品的测定
由杭州埃夫朗生物制品公司提供血清阳性和阴性样品各一份，按稀释比为11100，11500进行稀释，本法测得阳性血清的~BsAg数值为0.9ng·mL-1，0.21ng·mL-1，阴性血清无信号，而ELISA方法在11100~BsAg稀释样品中的测定值为0.8ng·mL-1，在11500稀释样品中已无信号.上述结果表明，在临床检验中，磁性微球免疫伏安法的灵敏度明显高于常规ELISA方法.
3结论
本文提出纳米磁性微球化学键合抗体，采用免疫伏安法测定~BsAg的方法，不仅简便快速，特异性好，而且检测下限大大低于临床采用的ELISA方法.实验中所合成的纳米磁性功能高分子微球，与抗体结合强度高，反应时间短，磁分离性能好，与灵敏的电化学方法结合，在临床免疫分析方面显示了良好的应用前景.
致谢作者感谢浙江大学分析测试中心曾跃武、朱京平老师为磁性微球作了电镜表征，冯春木老师提供了微球的磁性测试数据.
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0542化学学报Vol.62，2004
纳米磁性微球免疫伏安法测定乙肝表面抗原
作者：程琼， 彭图治， 刘爱丽
作者单位：程琼(浙江大学化学系,西溪校区,杭州,310028;嘉兴学院生物与化工学院,嘉兴,314001)， 彭图治,刘爱丽(浙江大学化学系,西溪校区,杭州,310028)
刊名：
化学学报
英文刊名：ACTA CHIMICA SINICA
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