保健食品多种矿物质维生素咀嚼片中泛酸钙含量测定的不确定度评定

保健食品多种矿物质维生素咀嚼片中泛酸钙含量
测定的不确定度评定
田京歌，冯有龙
（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏南京 210019）
摘　要：目的：评估高效液相色谱法测定保健食品多种矿物质维生素咀嚼片中泛酸钙含量的不确定度。

方法：通过对不确定度的来源进行分析，建立数学模型，并对不确定度的各分量进行计算和合成，得出测定结果的 不确定度。

结果：当咀嚼片中泛酸钙的含量测定结果为0.312 g/100 g时，扩展不确定度为0.009 3 g/100 g（k2）。

结论：试验过程中不确定度的主要来源是标准曲线溶液的配制过程、测定的重复性及方法的回收率，该方法可为高效液相色谱法测定保健食品中泛酸钙含量的不确定度评定提供参考。

关键词：泛酸钙；不确定度；高效液相色谱；保健食品
Evaluation of Uncertainty for Determination of Calcium Pantothenate in Multi-mineral Vitamin Chewable Tablets of
Health Food
TIAN Jingge, FENG Youlong
(Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210019, China) Abstract: Objective: To evaluate the uncertainty of the determination of calcium pantothenate in multi-mineral vitamin chewable tablets of health food by high performance liquid chromatography. Methods: By analyzing the sources of uncertainty, establishing a mathematical model, and calculating and synthesizing each component of the uncertainty, the uncertainty of the measurement result was obtained. Results: When the content of calcium pantothenate in the chewable tablet was 0.312 g/100 g, the expanded uncertainty was 0.009 3 g/100 g (k=2). Conclusion: The main sources of uncertainty during the experiment were the preparation process of the standard curve solution, the repeatability of the determination, and the recovery rate of the method. This method can provide a reference for the evaluation of uncertainty in the determination of calcium pantothenate in health food by high performance liquid chromatography.
Keywords: calcium pantothenate; uncertainty; high performance liquid chromatography; health food
泛酸又称遍多酸或维生素B5，是一种水溶性维生素，是辅酶A和酰基载体蛋白生物合成的重要前体物质，参与生物体内碳水化合物、脂肪、蛋白质和能量代谢，但游离泛酸对热、酸和碱均不稳定[1-2]，因此工业应用通常使用稳定性好的衍生物——泛酸钙。

泛酸钙通常作为一种营养强化剂添加于多种食品和保健食品中，以补充泛酸摄入的缺失，保证人体正常的新陈代谢，保健食品作为一种特殊的食品，越来越引起人们的重视。

测量不确定度可以合理的表征测量结果的范围区间，并关系着合格结论的判定，可以更好地评价测量结果的准确度[3-5]。

泛酸钙作为一种重要的营养补充剂，准确测定其含量可以更好地评价保健食品的质量。

目前文献报道多是关于食品中泛酸含量测定的不确定度评定[6-7]，未见有保健食品中泛酸钙含量测定的不确定度评定。

本文参考《保健食品中泛
作者简介：田京歌（1988—），男，山东泰安人，硕士，主管药师。

研究方向：药品保健食品检验与质量研究。

酸钙的测定》（GB/T 22246—2008）[8]，采用高效液相的方法测定了生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙的含量，为了评价泛酸钙测定结果的准确度，提高检测水平，本试验依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）和 CNAS-CL006：2019 化学分析中不确定度的评估指南程序对不确定度来源进行了分析[9-10]，参考相关文献[11-12]，计算不确定度各分量，并合成结果，以此来评价各个因素对测定结果的影响，进而提高检测水平，控制检测质量，同时为其他相关不确定度评定提供参考。

1　材料与方法
1.1　材料与试剂
泛酸钙（批号100370-201903，质量分数96.8%）来源于中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Merck公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团有限公司）；磷酸（色谱纯，阿拉丁公司）；水为去离子水（经Milli-Q水处理系统得到）；生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片（江苏省食品药品监督检验研究院提供）。

1.2　仪器
高效液相色谱仪（Agilent 1260，DAD检测器）；超声波清洗器（型号为KH-250DB，昆山禾创超声仪器有限公司）；电子天平（型号CPA224S，赛多利斯）。

1.3　试验方法
1.3.1　色谱条件
色谱柱为ACE 5 Excel 5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH=3.0）-乙腈=95∶5；检测波长为200 nm，流速1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 µL。

1.3.2　溶液的制备
（1）对照品标准储备液的制备。

称量泛酸钙标准品约0.1 g（精确至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀。

（2）对照品标准使用液的制备。

精密量取泛酸钙储备液5 mL置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（3）标准曲线的制备。

吸取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和8.00 mL泛酸钙标准使用液（相当于2.5 µg、5.0 µg、10.0 µg、20.0 µg、40.0 µg和80.0 µg泛酸钙），分别置于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

在给定的仪器条件下，进行色谱分析，以峰面积对浓度作标准曲线。

（4）供试品溶液的制备。

称取0.3 g粉碎后的均匀试样（精确到0.001 g），使试样浓度位于标准曲线中。

试样置于25 mL容量瓶中，加水20 mL，超声处理20 min后，加水至刻度，摇匀，过0.45 µm滤膜，即得。

1.3.3　数学模型的建立
试样中泛酸钙的含量计算如下：
100
=
1 000 1 000
C V
X
m
××
××
（1）式中：X-试样中泛酸钙的含量，单位为g/100 g；C-由标准曲线求得进样液中泛酸钙的浓度，单位为µg/mL；V-试样定容体积，单位为mL；m-试样的质量，单位为g。

2　结果与分析
2.1　不确定度来源分析
根据检测过程和数学模型分析，泛酸钙含量测定相对标准不确定度u r（X）的来源主要有以下几个方面，具体见图1。

其不确定度的来源包括：供试品的称量引入的相对标准不确定度u r（M t）、供试品的定容体积引入的相对标准不确定度u r（V t）、供试品的重复测定引入的相对标准不确定度u r（Rp）、方法回收率引入的相对标准不确定度u r（Rc）、供试品溶液的浓度引入的相对标准不确定度u r（C），其中u r（C）来源于对照品储备溶液的制备过程、对照品标准溶液制备过程、标准曲线因素等。

u r（Rp）
u r（C）
u r（Rc）u r（M t）u
r
（V t）
图1　不确定度来源分析图
2.2　不确定度评定
2.2.1　供试品的称量引入的相对标准不确定度u r（M t）
CPA224S型天平为万分之一天平（d=0.1 mg），检定证书的最大允差为±0.000 5
，按照矩形分布，k2份，减重法称重，2次的称样量分别为0.305 1 g，0.302 4 g。

则称样量的相对标
准不确定度为u
M 10.001 338r t =（）
=，
u M
（2
0.001 350r t =）=，则供试品称量
引入的相对标准不确定度为u r （M t ）
=
0.001 334=）=。

2.2.2　供试品的定容体积引入的相对不确定度 u r （V t ）
本次试验中所用的玻璃仪器的容量允许误差引入的不确定度均按B 类不确定度进行评定，容量瓶的体积变化相对液体可以忽略，只考虑液体的膨胀引入的不确定度，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃
室温度控制在（20±5） ℃，服从矩形分布，k = 则环境温度变化引入的
相对标准不确定度为
4
1
0.000 606 2r t u V −=（）=；试验采用25 mL 的容量瓶，由国家计量检定规程JJG 196—2006[13]查得其容量允差±0.030 mL
，则其引入的相对
标准不确定度为20.000 692 8
r t u V =（）
=，则 0.000 920 6r t u V =（）。

2.2.3　供试品的重复测定引入的相对标准不确定度
u r （Rp ）
在检测过程中，测量重复性引入的不确定度包括了各种随机因素，如人员实验操作熟练程度、仪器性能等，该不确定度属于A 类不确定度，平行制备12份供试品溶液，按照“1.3.1”项下的色谱条件进行12次测定，泛酸钙的含量分别为0.297 g/100 g 、 0.285 g/100 g 、0.301 g/100 g 、0.308 g/100 g 、0.308 g/100 g 、 0.287 g/100 g 、0.298 g/100 g 、0.300 g/100 g 、0.292 g/100 g 、 0.302 g/100 g 、0.287 g/100 g 和0.291 g/100 g ，测得重复测量（n =12）的平均值为X
=0.296 g/100 g ，标准偏差SD （Rp ）=0.007 935，则重复测量产生的相对不
确定度为u Rp r （）
=。

2.2.4　方法回收率引入的相对标准不确定度u r （Rc ）
按照低、中、高3种浓度水平（m =3）进行加样回收试验，使待测样品量与加入对照品的量比例分别为1.0∶1.0、1.0∶0.5、1.0∶1.5，每种浓度制备3份供试品，计算方法回收率，结果分别为94.8%、93.7%、95.2%、95.4%、96.5%、93.7%、
94.8%、98.2%和92.3%，方法回收率不确定度属于A 类不确定度，平均回收率
Rc =95.0%，标准偏差SD （Rc ）为1.71%，则回收率的相对标准不确定度为
u Rc
r （）=，采用t
检验的方法来分析方法平均回收率与回收率100%之间是否有显著性差异，以此判断是否需要用回收率对计算结果进行修正，100%()
Rc t u Rc −=
，而在自由
度为8，置信概率为95%下，t 0.95（8）=2.31，因t ＞2.31，故本试验中需要用回收率来修正计算结果，则供试样品中泛酸钙的实际含量0.296
=
=0.312 g/100 g 95%
t X 。

2.2.5　供试品溶液的浓度引入的相对标准不确定度u r （C ）
（1）对照品储备溶液的浓度引入的相对标准不
确定度u r （C 0）。

对照品储备溶液浓度的标准不确定度由对照品纯度和称量等因素引入。

泛酸钙对照品由中国食品药品检定研究院提供，说明书中对照品纯度为96.8%，未注明不确定度值，暂假设其
纯
度为96.8%±0.05%，服从矩形分布（k =）， 则对照品纯度引
入的相对标准不确定度
为u p 0.000 298 2r
=（）=。

对照品称量引入的不确定度由天平的最大允差计算，采用的为万分之一天平（d=0.1 mg ），检定证书的最
大允差为±0.000 5，按照矩形分布（k ），采用减重法称
重，称取对照品
量为0.101 6 g 为u w （0.004 018r =）
=。

对照品储备液配制过程中使用的是
100 mL 的容量瓶，其为A 级，查得其容量允差为±0.10 mL ，按矩形分布，则玻璃器皿引入的相对标准不确定 度为1000.000 577 4r u
=（）=；因环境温
度变化而引入的
相对标准不确定度为（u t 40.000 606 2r −=）
=，合成对照品储备 液配制过程引入的
相对标准不确定度为
u T （00.000 837 2r
=）
=。

将上述不确定度分量合成，得到对照品储备
溶液的浓度引入的相对标准不确定度为u r （C 0）=
0.004 115=）=。

（2）标准溶液的配制过程引入的相对标准不
确定度u r （V 0）。

本试验中由对照品储备液配制对照品工作溶液，之后配制成标曲系列浓度，均会采用玻璃量具，包含刻度吸管、容量瓶等，按
照国家计量检定规程的要求，都有相应的允差，按照矩形分布计
算，k =由此来计算所采
用的玻璃器皿的相对标准不确定度分量，具体见 表1。

表1　玻璃器皿引入的不确定度
玻璃器具使用次数
最大允差/mL
允差引入的相对标准
不确定度
温度变化引入的相对标准
不确定度
合成相对标准不确定度10 ml 容量瓶6±0.0200.001 1550.000 606 20.001 30450 mL 容量瓶1±0.0500.000 5770.000 606 20.000 8375 mL 移液管1±0.0150.001 7320.000 606 20.001 8351 mL 刻度吸管3±0.0080.004 6190.000 606 20.004 65910 mL 刻度吸管
3
±0.050
0.002 887
0.000 606 2
0.002 950
（3）标准曲线的拟合引入的相对标准不确定度 u r （C 1）。

本试验中系列标准溶液按1.3.1色谱条件分别测定1次，结果见表2。

表2　标曲溶液测定结果
浓度C i （µg/mL ）峰面积（A i ）线性方程
相关系数（r 2）
平均浓度C
2.45936.559A =1
3.693 5C +1.851 3
1.000 0
25.82
4.91766.9749.835137.18019.670270.41639.340542.71278.679
1 078.378
其中，斜率a =13.693 5，截距b =1.851 3，则拟合标准曲线峰面积A 残差的标准偏差
为
() 1.760 6
S A ==，
n 为测定次数，n =6。

对供试品溶液重复测定12次，p = 12，计算得到供试品中泛酸钙的含量为
X =0.296 g/100 g ，C 0=35.88 µg/mL ，则u r (C 1)为：
r 1
1.760 60.001 875
13.693 535.88
u C ==
×=×（）将以上不确定度分量合成得
到u r （C ）
0.011 2=）=。

2.3　合成不确定度及扩展不确定度
综上分析，本试验中高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC ）测定生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙含量的各
相对标准不确定度分量见表3。

将上述不确定度合成得到合成相对标准不确定
度为
表3　相对标准不确定度
不确定度分量
不确定度来源类型相对标准不确定度值
u r （M t ）供试品的称量B 0.001 344u r （V t ）供试品的定容体积B 0.000 921u r （Rp ）供试品的重复测定
A 0.007 739u r （Rc ）方法回收率A 0.006 000u r （C ）
对照品储备溶液的浓度B 0.004 115标准溶液的配制过程B 0.010 27
标准曲线的拟合
A
0.001 875
u X （0.014 97r =）
=。

本试验中测得供试品中泛酸钙的实际含量为X t =0.312 g/100 g ，合成标准不确定度为：
U X u X X g g 1
=()0.014 970.3120.004 671 /100 h r t ×=×=（）取包含因子为k =2
，置信概率为95%，则扩展不
则标曲各溶液配制过程中引入的相对标准不确定度为
u V 00.010 27r =（）。

确定度为：U=2×U h(X1) =2×0.004 671=0.0093 g/100 g，因此，HPLC法测定生命力牌多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙含量的结果可表示为：（0.312±0.009 3） g/100 g，k=2（95%的置信区间）。

3　结论与讨论
本文对采用HPLC法测定保健食品多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙的含量进行了不确定度评定，通过计算各个相对标准不确定度，可以推测得出试验中不确定度的来源主要是标曲溶液的配制，其次是样品测定的重复性，方法回收率及对照品储备溶液浓度的影响，最后是标准曲线的拟合及供试品称量及定容体积的影响。

因此，在以后的试验测定中要加强对以上影响因素的控制，改进试验方法，尽可能减少试验误差，提高检测数据的质量。

测量不确定度是完整试验数据的一部分，最终得到的扩展不确定度即是测量结果在一定置信水平上的置信区间[14-15]。

本试验以多种维生素矿物质咀嚼片中泛酸钙含量测定为例，对测量结果进行了不确定度评定，可以为其他保健食品中功效成分含量测定的评定和相关质量标准的研究提供参考。

参考文献
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