转基因食品检测方法的研究进展

转基因食品检测方法的研究进展
周少芸
(福建省漳州市产品质量监督检验所,福建漳州363000)
摘　要:主要介绍了转基因食品的检测方法及其原理,以及转基因食品检测方法的优缺点。

关键词:转基因食品;检测方法;研究进展
中图分类号:Q343.1　文献标识码:A　文章编号:1008-9799(2007)01-0043-03
转基因食品即利用分子生物学手段,将某些生物的基因转移到其它物种中去,使其出现原物种不具有的性状或产物,以转基因生物为原料生产和加工的食品称为转基因食品[1],又称基因工程食品或基因修饰食品(简称G M食品)。

在欧盟新型食品条例中将转基因食品定义为:一种由转基因修饰的生物体生产的或该物质本身的食品[2]。

我国《转基因食品卫生管理办法》规定:转基因食品系指利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂,包括①转基因动植物、微生物产品;②转基因动植物、微生物直接加工品;
③以转基因动植物、微生物或者其直接加工品为原料生产的食品和食品添加剂。

迄今为止,转基因牛、羊、鱼、虾、粮食和水果在国内外均已成功并已投入食品市场。

为了对转基因食品进行检测,研究者已开发了多种用于转基因食品的检测方法,但所开发的各种技术并不完善,只有为数不多的检测方法在协同实验室中获得了一致的结果。

转基因食品的检测方法主要有两大类:对外源基因的检测和对外源蛋白的检测[3]。

文章综述了目前相对已经成熟的并已广泛应用的对转基因食品的检测方法。

1　外源基因的检测
1.1外源基因的定性检测
1.1.1聚合酶链式反应(Poly merase Chain Reacti on PCR)　目前对于外源基因的检测主要是通过对转入的外源基因进行PCR扩增,然后进行紫外或荧光检测。

PCR是在DNA聚合酶、引物及模板DNA 存在的条件下对离体DNA进行扩增的一种方法[3]。

要进行PCR扩增必须知道待扩增DNA的序列。

转基因食品中的外源基因不仅仅包括外源蛋白编码序列,还包括选择性标记基因和对于外源基因发挥作用所必须的功能基因。

根据所选择的用作模板的外源基因的不同,PCR实验可分为不同的类型。

如果所选择的DNA序列是广泛存在于转基因植物中的序列,如35S启动子和NOS终止子,则这种实验将不具有专一性,这种扩增能检测出多种不同的转基因食品。

但如果所选择的扩增靶序列既包括启动子又包括特定的外源基因,或者是既包括特定的外源基因又包括终止子则PCR实验将具有专一性。

1.1.2巢式和半巢式PCR　巢式PCR(nested PCR)是在普通PCR基础上发展起来的一种PCR技术,分子生物学研究和医学检测方面研究较多。

其原理是设计2对引物,其中1对引物在另1对引物扩增产物的片段上,通过2次PCR反应对某个基因进行检测。

通常第1次采用能扩增较大片段的引物,经过20～30次循环扩增后,将第1次扩增的产物作为模板进行第2次扩增[4]。

半巢式PCR(se m i-nestedPCR)的原理与巢式PCR基本相同,只是半巢式PCR只有1对半引物,有1个引物被用于2次PCR反应中。

这2种方法不但可以减少假阳性的出现,而且可以使检测的下限下降几个数量级。

从理论上来说,用巢式和半巢式PCR可以检测到低于10-11g/μL的DNA模板量。

实际上食品中DNA的破坏,可供利用的有效模板可能会远远低于其通过紫外分光光度计测定的DNA模板量。

如豆油、大豆磷脂以及其它产品中的DNA受到严重破坏,用普通PCR不能完全检出是否含有大豆成分和转基因大豆的成分,即使检出,其重复性也不好。

而利用巢式PCR和半巢式PCR 可以克服普通PCR的这一缺陷。

巢式PCR和半巢式PCR技术抗干扰性也是比较好的。

一般来说,巢式PCR和半巢式PCR具有高度的特异性,其结果一般不需要再用其他方法来验证。

1.1.3复合扩增PCR(Multi p-lex PCR)　复合扩增PCR是在同一反应管中含有1对以上引物,可以同时针对几个靶位点进行检测的PCR技术。

该技术不仅效率高,而且因为它是针对多个靶位点进行同时检测,所以其检测效果较之普通PCR更为可信。

陶震、刘光明等人就利用该方法同时检测待测大豆、马铃薯等样品的Ca MV35S启动子和NOS终止子,均取得了满意的结果[5,6]。

收稿日期:2007-02-20
34
福建稻麦科技,2007,25(1)
1.1.4核酸印迹法(Southern bl ot)　W u等人用核酸印迹法判断西红柿的假定的转化株的基因组DNA 中是否含有转入的DNA。

Jennings等用核酸印迹法杂交判断B t玉米中cry1Ab基因的211bp片段和玉米内源基因sh2(编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶)的213bp片段的存在。

1.2外源基因的定量检测
1.2.1定量PCR　随着各国有关G MO标签法的建立和不断完善,对食品中的G MO含量的下限已有所规定。

定性筛选PCR本身具有的局限性显现出来,特别是无法对G MO进行定量分析。

目前定量检测方法如竞争性定量PCR方法(QC-PCR)和实时定量PCR方法(real-ti m e PCR)已被一些国家的政府实验室采用。

1.2.1.1竞争性定量PCR　法构建理想的内标是竞争性定量PCR法的关键。

前提是假定内标具有和靶基因相同的动力学特点和扩增效率,并且要求DNA片段大于100bp[7]。

目前,内标法构建的方法有:靶基因扩增产物的突变;限制性片段的插入或缺失;含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列等。

单竞争性PCR因为没有考虑样品分析中可能发生的DNA降解,通常被用来进行半定量测定,适合于原材料和未加工食品的分析。

双竞争性PCR 法则同时考虑了DNA的断裂和扩增两个因素,并且有应用设备成本相对较低的优点。

其主要问题是异源双链核酸分子的构成会改变PCR反应中靶基因和内标扩增产物的比率,而异源双链核酸分子有相似的电泳特性也会使随后的扩增产物的电泳分析复杂化[8]。

1.2.1.2实时定量PCR　法日本、韩国和美国等的13个实验室参加的针对5个品种转基因玉米B t11、T25、MON810、G A21、Event176和1种转基因大豆Roundup Ready的研究结果显示,实时定量PCR 方法能特异定量检测G MO,测定限B t11、T25和MON810为0.5%,而对G A21、Event176和Roundup Ready大豆的为0.1%;盲样测试结果表明这种方法可以应用于转基因作物标识制度的实际检测[9]。

实时定量PCR特异测定G MO的检测限(LOQ),在实验上达到了30～50个目的分子,接近理论预期值。

实时定量PCR方法的主要缺点是荧光标记探针会在一些食物基质中水解和操作的仪器较贵。

1.2.2PCR-EL I S A　这是一种将PCR的高效性与EL I S A高特异性结合在一起的检测方法,它利用地高辛或生物素等标记引物,将PCR扩增产物与固相板上特异的探针结合,再加入抗地高辛或生物素的酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最后使底物显色,在酶标仪上读取数值[10]。

利用PCR-EL I S A 法对转基因大豆检测,灵敏度比欧盟推荐的PCR 方法高5～10倍。

它快速方便,避免了有毒物质EB的使用,适合大批量自动检测。

1.2.3基因芯片(gene chi p)技术　基因芯片又称DNA微阵列,将芯片与待测的荧光标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交后,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对其表面进行扫描即可获取样品分子的数量和序列信息[11]。

将大量的核酸分子同时固定于玻璃、硅等载体上,可同时检测、分析大量的DNA/RNA,因而具有灵敏、高效、低成本、自动化等优点。

目前欧盟及质检总局源基因食品检测技术中心都在研究源基因食品检测芯片,现在已研究出一些产品,正在做验证实验,但没有商品化。

我国开发的转基因产品检测芯片基本上能实现:确定是否是源基因食品、是哪一种源基因食品、是否是我国已批准的源基因食品。

目前研制的芯片能检测国内外已批准商品化转基因作物物种:大豆、玉米、油菜、棉花、马铃薯、烟草、西红柿、木瓜、西葫芦、甜椒等;含有启动子、终止子、筛选基因与报告基因等通用基因位点用作筛选是否是源基因食品;含有并包括抗、耐除草剂、雄性不育与育性、恢复基因等各物种特有的目的基因,及品种特异的边界序列用于确定是哪个转基因品种。

2　外源蛋白质的检测方法
2.1蛋白质印迹法(W estern bl ot)
蛋白质印迹法将电泳的较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来,是检测复杂混合物中特异蛋白质的最有力的工具之一,普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质,灵敏度为1～5 ng。

它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质,特别用于不可溶蛋白质的分析[8]。

Van Duijn等人用蛋白质印迹法检测Roundup Ready大豆中的CP4合成酶,检测限在0.5%～1%。

经验证这种方法可以应用于转基因Roundup Ready 大豆原材料和大豆蛋白质产品的检测。

2.2酶联免疫吸附试验(enzy me-linked i m munos or2 bent assay,E L I S A)
这种蛋白质检测方法具有商业可利用性并具有高度选择性和灵敏性。

免疫测定的主要缺点之一是复杂基质对它的准确性和精确度有干扰。

许多存在于食物基质中的物质,如表面活性剂(皂角苷)、酚
44福建稻麦科技,2007年3月(Mar.2007)
化物、脂肪酸、内源磷酸(酯)酶,可以抑制特异的抗原-抗体相互作用;外源基因表达的蛋白质在较低水平时或热处理变性时,检测能力下降;某些导入蛋白质并不是在植物的所有组织中均有表达;在加工过程中蛋白质会发生降解。

因此这种技术只适合未加工的原材料的检测。

而且如果导入的DNA的蛋白质没有表达,也不能应用这种技术。

DNA比起蛋白质具有更多的热稳定性,能够在食物加工过程中存留[11]。

2.3“侧流”型免疫测定(Latera Fl ow)
与E L I S A相似,“侧流型免疫测定也是基于三明治夹心式技术原理,但该法是在一种膜支持物上,标识的抗原-抗体复合物侧向迁移,直至遇到在一种固定表面上的抗体。

所用的设备中一般包括了所需的试剂[3]。

市场上也出现了用于侧流分析并能用于野外测试的试剂盒。

与DNA的测定相比,特性蛋白分析的一个重要特点是样品处理简单。

目标蛋白一般是水溶的且抗体具有高度专一性,样品仅需粗提便能达到测试的要求。

因此这种测定具有如下优点:分析迅速,可用于野外操作,且易于避免由于样品的制备不适当而产生的错误结果。

免疫蛋白实验通常仅限于对植物叶、种子的分析,因为抗体只识别没有变性的蛋白,但也有报道目前已能制备热变性后的蛋白抗体。

而在一些情况下,则无法对转基因食品进行免疫学蛋白测定,因为在一些情况下外源基因并不表达蛋白。

在此情况下,只能采用转基因DNA的测定。

2.4试纸条法(Lateral Fl ow Stri p)
将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上,当纸上抗体和特异抗原结合后,再和带有颜色的特异抗体进行反应,就形成了带有颜色的三明治机构,并且固定在试纸条上,如果没有抗原,则没有颜色[11]。

因此整个操作相对简单。

目前市场上也出现了一些此类测试的试剂盒。

外源蛋白质检测法快速,具有一定的灵敏度,也能进行半定量,尤其是试纸条法,不需要特殊的仪器设备,适用于现场检验或初筛。

由于抗原抗体反应的专一性,每种转基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法,而转基因产品种类繁多,要建立所有转基因产品的蛋白质检测法工作量很大;对于加工过的转基因食品,其蛋白质很容易被破坏,从而影响检测结果的准确性;有些插入基因还具有表达部位特异性,这些基因的表达并不象DNA 那样存在于转基因作物的任何部位,甚至有的转基因产品的插入基因根本不表达或表达量很低。

这些都会影响检测结果。

3　展望
以上各种不同的方法有不同的特点。

但随着国内外对转基因产品研究的深入以及对转基因产品检测要求的提高,人们要求更准确、快速、简便、高效而且成本低廉的检测技术的问世。

同时,现有的检测技术也需要不断改进以克服自身的缺陷。

目前,色谱技术(如HP LC)、毛细管电泳技术和超分支滚环扩增技术在转基因产品的检测方面亦有所应用。

总之,转基因食品检测技术的发展趋势应是快速简便、低耗费、适用面广,能满足对已有或新型转基因食品进行快速准确的检测要求。

参考文献
[1]丁武,魏益民.关于转基因食品[J].中国食物及营养,
2003(1):14-17.
[2]邓郁琼,郑裕强,黄奋.转基因食品及其挑战[J].食品科
技,2001(1):11-l3.
[3]邵素琴,李建中.转基因食品的检测方法[J].农药科
学与管理,2002,23(3):26-27
[4]黄昆仑,罗云波.用巢式和半巢式PCR检测转基因大
豆Roundup Ready及其深加工食品[J].农业生物技术
学报,2003,11(5):461-466.
[5]刘光明,李庆阁,王群力,等.多重荧光PCR同时检测
转基因成分35S和NOS方法的建立[J].厦门大学学报
(自然科学版),2002,41(4):493-497.
[6]刘光明,苏文金,梁基选,等.多重PCR方法检测食品
中转基因成分[J].无锡轻工大学学报,2002,21(4):
379-383.
[7]W ise man G.State of the art and li m itati ons of quantitative
poly merase chain reacti on[J].Journal of AOAC I nt,2002
,85:792-796.
[8]周萍萍,吴永宁,张建中.转基因食品检测方法的现况
与进展[J].中国食品卫生杂志.2004,16(3):254-
258.
[9]Shindo Y,Kuribara H,M atsuoka T,et al.Validati on of
real ti m e PCR analyses for line s pecific quantitati on of ge2 netically modified maize and s oybean using ne w reference
mole2cules[J].J AOAC I nt,2002,85(5):1119-
1126.
[10]赵文军,陈红运,黄文胜.PCR-E L I S A在转基因产品
检测中的应用[J].植物检疫,2001,15(5):297-
299.
[11]曹泽虹,高明侠.转基因食品的检测方法[J].中国食
品添加剂,2005(4):100-105.
54
福建稻麦科技,2007,25(1)。