微生物中的代谢足迹方法及在功能基因组和生物技术中的应用

胞外代谢物的自然角色
• 此外，代谢物还具有重要的作用，这就是所说的细菌群感 效应（QS），它依靠细胞感应胞外的代谢物。
• 细胞的群感效应是调控生物膜形成和其它生物学功能的机 制。细菌能够分析特定的信号分子并感应它的浓度，当信 号分子浓度达到阈值是，细菌就能够引发包括致病基因在 内的相关基因的表达，以适应环境的变化。
代谢足迹的分析工具
• 核磁共振法：核磁共振大量地应用于代谢组学的研究，得 益于它的特异性和非选择性。这就意味着，我们观察到的 每个共振对应于特异的化合物，它可提供一个样品中关于 结构的丰富信息。核磁共振不需要分析的预筛条件，比如 色谱分析的离子源或色谱分析的运行条件。
• 振动光谱法：傅里叶转换红外仪，是当前比较广泛应用的 技术，可以获得生物样本的光谱指纹。傅里叶转换红外仪 具有快速、无需反应试剂，对复杂生物样本的非破坏分析 等优点，因此，便于高通量筛选和无偏性的测定。该技术 的主要缺点是灵敏度相对较低，这使得我们很难将得到的 信心整合到生物信息当中去。
代谢足迹的应用和可能的成果
• 高通量应用的一般过程和数据库
代谢足迹的一个主要的优点是它作为一种高通量的分析方法，使用简 单，能同时用于实验室的研究和工业的就地生物处理过程。 另外，与代谢指纹相比，代谢足迹不需要任何复杂的操作程序，比如 抑制（快速阻断）胞内代谢物，从代谢物从细胞中提取出来以及随后 的处理以便于分析。对胞内代谢的真正分析前所需要的步骤的多寡， 另外耗时长和高的成本，都可能影响结果的可靠性和可重复性，因此， 较少的操作步骤也是代谢足迹的一个优势 为了把代谢足迹开发成适合高通量应用的代谢组技术，需要具有确定 峰的标准图谱，因此从MS或NMR分析得到的峰模式才能被转译成相关 的生物信息。基于此，详细的光谱数据库的建立，对所有代谢组的分 析，都是非常重要的，但对高通量代谢足迹则尤为重要
结论
• 我们能从代谢足迹的分析中获得关于微生物系统的重要信 息，此外，基础和应用研究也能从中获益。
• 尽管代谢足迹是代谢组学的研究方法，最适合于 高通量的分析，但是当需要进行快速的代谢物分 析时，就存在着一些问题。解决问题的方法就是 建立的光谱数据库，一旦得到代谢足迹的图谱， 该数据库就能作为参考的标准。
胞外代谢组与胞内代谢组的偶联
代谢足迹能带来的重要生物的信息
代谢足迹的应用和可能的成果
• 通过代谢足迹进行细菌群感效应的研究
很多病原菌利用细菌群感效应（QS）机制来进行增值和攻击它们的宿 主。 慢性疾病的感染主要原因是具有在生物膜系统中持续存在的能力， 而这些生物膜系统通常是攻不破的，即使在抗生素的压力下，比如由 菌绿假单胞菌引起的肺腑感染。在这些条件下，特异性地靶向靶向能 诱导生物膜形成的QS分子，将是一种消灭微生物毒力的很有前景的方 法，由于没有威胁到微生物的生存，因此降低了导致耐药性突变的选 择压力的发生。然而，由于QS分子的性质和作用方式的多样性，这些 因素能改变依靠QS分子的浓度和感染情况，因此，QS分子拮抗物的设 计可能不是很容易完成的工作。
代谢足迹的分析工具
质谱偶联： 它包含所有的这些分析技术，先对代谢物进行色 谱分离再进行质谱分析，因此能对代谢物进行定 性和定量的分析。在代谢组中，最常用的色谱分 析技术是气相色谱（气相色谱-质谱），还有经常 用于靶向分析的高效液相色谱（高效液相色谱-质 谱），另外还有毛细管电泳（毛细管电泳-质谱）。 目前，飞行时间质谱分析器是代谢组分析的首选 仪器，因为它具有全质量扫描能力和提供全部的 质谱图，所以使得它对代谢物的检测具有很好的 灵敏度。
举个例子，在厌氧条件下或在有氧条件，但存在氧化抑制剂情况下，啤酒酵 母产生乙醇，以维持合适的氧化还原的平衡。在厌氧条件下，啤酒酵母不能 消耗它产生并释放到环境中的乙醇，但在有氧条件下，酵母能利用乙醇作为 碳源，从而导致碱性厌氧代谢到有氧呼吸代谢的转换。
那些不是由细胞分泌或排出的代谢物（比如磷酸烯醇式丙 酮酸，）在胞外的存在，可作为细胞溶解的一个标记，因 此能够向我们提供细胞特定生长条件下的一些信息，比如 pH，渗透压，它们能指示细胞内压力
代谢足迹给我们提供了功能基因组学和菌 株特性的一些重要信息
代谢足迹为科学家对细胞通讯，代谢工程 和生物技术工艺的认识提供重要的方法
代谢足迹能够给我们提供一些关于胞内代 谢情况的重要信息
从代谢足迹中得到的重要信息给能够帮助 我们进一步破译代谢网络
在代谢组分析中提到的一些概念
• 代谢组：由细胞合成的，与代谢作用有关的一整套代谢物。 代谢组由胞内代谢组和胞外代谢组构成。
• 当前，通过从代谢足迹中挖掘出信息，代谢图谱 和数据库能够进一步更新升级，这有利于我们更 好的定义生物系统，同时，反过来，也有利于生 物技术的应用。
代谢足迹的应用和可能的成果
• 新的代谢途径的发现和代谢工程
目前，相当多的工业研究兴趣聚焦在植物纤维的降解上，通过发酵的 方法，将其作为原材料用于乙醇或其它燃料和化合物的生产。在这方 面研究的一个主要目标是使植物多糖（纤维素和半纤维素）进行完全 地降解成单糖（木糖和阿拉伯糖），理想的是不使用化学试剂或只采 用酶催化的方法。微生物和反应条件的优化仍有待于研究，但代谢足 迹提供了一个重要的信息，使得我们能够通过鉴定胞外培养基中的降 解产物来衡量降解的程度。 对来自于降解纤维素的微生物的胞外代谢物进行定性和定量的研究， 能够提供针对瓶颈的重要线索和之前没被鉴别的微生物代谢途径。这 些信息能与转录组学和蛋白组学的数据结合起来，进一步表征那些参 与纤维降解的基因或相关的代谢途径。 代谢足迹还可以应用于生物修复。在生物修复领域，通过放射性同 位素标记底物来跟踪异性生物质的不同降解途径，对代谢途径和可能 的代谢抑制进行检测和表征，将得到进一步的改善。
• 代谢指纹：由核磁共振或质谱分析获得的光谱图，提供由 胞内代谢物得到的“印记”。一般地，代谢指纹并不提供对 特定代谢物的定性或定量的检测。
• 代谢足迹：由核磁共振或质谱分析得到的光谱图，提供由 胞外代谢物得到的“印记”。一般地，代谢足迹并不提规 律的发展，这些数据涉及到的只是少数的变量。对代谢指 纹和代谢足迹的平行分析，能够显示胞内代谢物与胞外代 谢物可能的相互联系，因此能帮助我们鉴定可能的新的代 谢物功能。
这种方法依靠对小部分的差异（质谱峰）的鉴定，这些差异的变化有 一个规律，就是它们与特定的突变有关。因此，代谢足迹能够用于第 一轮的分析，确定能区分归因于变异的质谱峰。 微生物菌种的快速鉴别不仅与功能基因组学有关，而且与工业生物 技术有关，在工业生物技术中，新的高产菌株的鉴定具有重要的意义。 举个例子来说，通过代谢足迹对啤酒酵母进行鉴别和分类，揭示了对 那些由于基因组的内在复杂性，而不能在基因水平上区分的啤酒酵母 菌株进行分类是可行的
胞外代谢物的自然角色
在胞外微环境中，胞外代谢物水平的任何改变都会直接反 映由体系中微生物活动而引起的环境的变化。
举个例子，营养会被消耗，许多胞外代谢物作为代谢活动的副产物会形成。 此外，微生物所接触的环境的真实状况，会影响微生物的代谢状况，进而影 响到释放到微环境中的代谢物。
微生物能根据微环境进行精细的调控以最大化地利用自然 资源。
代谢足迹的应用和可能的成果
• 生物过程的检测和开发
代谢足迹能带来大量的生化信息，这些信息连同先进的自动分析技术 的开发，使得代谢足迹成为一种能从工业水平上监测生物过程的诱人 的方法。遍及不同的生物生长阶段，微生物的胞外代谢组发生根本的 变化，各个不同的生长阶段可以用一特定的足迹来表征，这就意味着 简单地通过读取相应的质谱峰图可以确定培养物的状况 对生物过程而言，代谢足迹更重要的另一个方面是，可以用它来检测 细胞的生理状况和能够诱导胞内压力的环境条件。对于一给定的生物 过程，代谢足迹可能有助于我们筛选最合适的菌株和生长条件，另外， 通过代谢足迹，能够揭示细胞对环境压力和生物标记的存在的特殊反 应，这些反应能暗示环境中有毒化合物的存在。举个例子来说，在废 水生物处理的过程当中，污泥培养物的代谢足迹，使得我们能够将存 在于处理的水中不同类型的化学应力因素区分开来，比如镉，2,4DNT和N-ethyl-maleimide，并且这种方法为微生物感应器的环境监测 的开发铺平了道路。
在代谢组分析中提到的一些概念
• 代谢物谱型：对一组特定的具有相似物理化学 性质或代谢途径的代谢物进行定性和定量检测 后的分析结果。
• 代谢物靶向分析：对感兴趣的一种或几种代谢 物进行定量的分析，忽略样本中出现的非靶向 峰图。
代谢足迹的分析工具
直接喷射法质谱： 代谢样本直接喷射到离子源前，因此可以绕开色 谱的分离。电喷射离子化质谱通常用于极性代谢 物的检测，而大气压化学电离用于低极性和非极 性代谢物的分析，其灵敏度还有待提高。直接喷 射法质谱允许对原样品或样品的粗提物进行高通 量的分析，一般每个样品需要1到3分钟。直接喷 射法质谱的主要缺点是所谓的“基质效应”，它使 得检测不同基质的样本在灵敏度和定量的准确度 方面均有所下降
代谢足迹的分析可提供一种从微生物群落胞外代谢物中，鉴定出潜在 QS代谢物的有效方法
代谢足迹的应用和可能的成果
• 功能基因组学和菌株的鉴定
由于光谱技术在高通量应用方面的不断发展，还有与代谢指纹相比， 代谢足迹比较容易获得，这使得代谢足迹成为一种在功能基因组研究 中强有效的方法。酵母和大肠杆菌的不同基因突变，其基因是与代谢 组密切相关的，则根据代谢足迹能成功地将它们区分开来。