黄芪注射液对内皮细胞的增殖及表达E-Selectin和VCAM-1的影响

黄芪注射液对内皮细胞的增殖及表达E －Selectin 和VCAM －1的影响
沙如拉1
，吴
岩
2
(1．内蒙古自治区人民医院，内蒙古呼和浩特010017;
2．内蒙古医科大学)
摘
要：目的：了解黄芪注射液对内皮细胞增殖及分泌黏附分子VCAM －1和E －selectin 的影响，探讨黄芪注
射液对造血调控的机理。

方法：(1)．建立人脐静脉内皮细胞体外培养模型，
用免疫细胞化学方法及电子显微镜技术鉴定内皮细胞;(2)．将HUVEC 与黄芪注射液不同剂量(0μg /mL 、
4μg /mL 、40μg /mL 、400μg /mL 和4000μg /mL )一起培养，用MTT 法检测内皮细胞增殖;以流式细胞分析术测定内皮细胞增殖周期;以TNF 作为阳性对照，用ELISA 法对黏附分子VCAM －1和E －selectin 进行测定。

结果：(1)成功的建立了人脐静脉内皮细胞的体外模
型;用Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色结果为阳性、电镜检测到W －P 小体，证实培养细胞为人脐静脉内皮细胞。

(2)内皮细胞随着培养时间的延长，各组均显示出不同程度的促生长效应(Time :P ＜0．05;Concentration :P ＜0．05)。

(3)细胞周期检测显示实验组内皮细胞周期各时相的细胞数占细胞总数的百分比与黄芪组比较有明显的不同(P ＜0．05)。

S 期和G 2/M 期细胞显著增多(P ＜0．05)，
而G 0/G 1期细胞相对比例减少(P ＜0．05)。

(4)体外培养的内皮细胞可自然分泌VCAM －1。

各个浓度的黄芪注射液与TNF 一样均具有促进内皮细胞分泌VCAM －1的作用，其中400μg /mL 的黄芪注射液浓度是促进内皮细胞分泌VCAM －1的最佳浓度(P ＜0．05)，而且黄芪注射液具有协同TNF 的作用(P ＜0．05)。

(5)内皮细胞体外培养在没有任何刺激的情况下未检测到E －se-lectin．黄芪注射液刺激内皮细胞也未检测到E －selectin．内皮细胞在TNF 刺激活化后表达E －selectin．黄芪注射液能促进TNF 活化的内皮细胞分泌E －selectin (P ＜0．05)。

结论：本研究提示，
黄芪的补气生血途径之一可能是通过直接刺激内皮细胞增殖和分泌造血生长因子和黏附分子，从而间接发挥造血调控作用的;黄芪可能促进造血干祖细胞的归巢，并为开发黄芪用于辅助治疗血液病及肿瘤放、化疗后骨髓重建提供了理论依据。

关键词：黄芪注射液;内皮细胞;血管细胞黏附分子－1;e －选择素;造血干/祖细胞归巢
中图分类号：R329．2文献标识码：A 文章编号：2095－512X （2013）01－0012－07
IAPACT OF HUANGQI INJECTION ON THE PROLIFERATION OF ENDOTHELIAL CELLS AND EXPRESSION OF E －SELECTIN AND VCAM －1
Sarula ，WU Yan
（Inner Mongolia Autonomous Region People ＇s Hospital ，Hohhot 010017China ）
Abstract ：Objective ：To investigate the effect of Huangqi injection on proliferation and expression
of vascular cell adhesion molecule and E －selectin in human umbilical vein endothelial cells （HUVEC ）．To study the mechanism of Huangqi injiection on regulation of hematopoiesis．Methods ：（1）Human umbilical vein endothelial cells culture model was founded ，
Endothelial cells was identified by immunohistochemical staining and transmission electron microscope （2）Treating HUVEC with
·
21·Journal Of Inner Mongolia Medical University Feb．2013Vol．35No．S1
收稿日期：2012－10－11；修回日期：2012－12－14
作者简介：沙如拉（1981－），女，蒙古族，内蒙古自治区医院肿瘤内科住院医师。

通讯作者：吴岩，教授，医学博士，硕士研究生导师，
E －mail ；yanwu007@sina．com 内蒙古医科大学组胚教研室，010059DOI:10.16343/ki.issn.2095-512x.2013.s1.054
various concentration of Huangqi injiection（0μg/mL，4μg/mL，40μg/mL，400μg/mL，4000μg/mL）．Analyzed the proliferation of HUVEC by MTT；Analyzed the proliferation phase of HUVEC using flow cytometry，and measure the expression of VCAM and E－selectin by ELISA．Results：（1）The results of immunohistochemical staining on correlation antigens of VIII factor and Weible－Paladabody in the en-dothelial cells was observed by using transmission electron microscope．demonstrat that we established the human umbilical vein endothelial cells culture model．（2）Every groups has different influences on cell growth（Time：P=0．000＜0．05；Concentration：P＜0．05）．（3）There was significant change was found between the experiment group and the control group on the proliferation phase of HUVEC（P ＜0．05）．The number of cells in S phase and G2/M phase were significant increased，（P＜0．05）．The number of cells in G0/G1phase were reduced．（4）Endothelial cells were cultured in vitro can secret VCAM－1no stimulation．Different Huangqi injection and TNF can promoted the secretion of VCAM－1 from endothelial cells．400μg/mL Huangqi injection is the most proper concentration．（P＜0．05），meanwhile，Huangqi injection can promoted the roles of TNF（P＜0．05）．（5）Endothelial cells were cultured in vitro can not secret E－selectin no stimulation．Huangqi injection can not promoted the se-cretion of E－selectin from endothelial cells directly．Endothelial cells can been activated by TNF，Huangqi injection can promoted the secretion of E－selectin from activated endothelial cells（P＜0．05）．Conclusions：This research suggest that Huangqi injection can support hematopoiesis through endothelial cells and adhesion molecule，Huangqi injection may promote the homing of hematopoietic stem/progenitor cells．Theory basis was afforded for the clinical application of Huangqi injection．Key words：huangqi injection；endothelial cells；VCAM－1；e－selectin；stem cell homing
血管内皮细胞（endothelial cell，EC）不仅仅是充当血管内壁和血液之间的机械屏障，因其特殊的解剖学定位，成为构成髓血屏障的主要结构，是造血细胞出髓与归巢的“门户”［9］。

另外也是造血诱导微环境中重要的基质成分之一，通过与其它基质细胞的协同作用分泌多种造血调控因子，将造血干/祖细胞定居于“壁龛”中从而调控造血干/祖细胞的增殖和分化［10］。

黄芪是中医常用的补气升血的药物。

黄芪最擅长补脾肺之气，亦可通过补气生血，补气摄血，使有形之血生于无形之气。

中医理论认为，“有形之血生于无形之气”。

可见血的生成有赖于气，气可促进生血。

以往对黄芪的研究多集中在该药的临床应用效果及中医药理学的研究，对内皮细胞黏附分子VCAM－1和E－selectin表达影响的研究尚无报道。

本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞（HU-VEC）为模型，研究黄芪对HUVEC的生长周期和VCAM－1和E－selectin表达的影响，探讨黄芪对造血调控的机理及对造血干/祖细胞归巢中的作用。

1材料与方法
1．1主要试剂
培养液M199（GIBCO产品），小牛血清（GIBCO产品）。

0．1%胶原酶（Sigma产品），Anti－FactorⅧR：Ag（博士德产品），human sVCAM－1ELISA、human s E－selectin ELISA（Bender产品）黄芪注射液（河北神威药业有限公司）
1．2脐带标本
健康产妇剖腹产术后12h以内的脐带。

由本校附属第一医院产科提供。

1．3方法
1．3．1人脐静脉内皮细胞（HUVEC）体外培养模型的建立取健康产妇剖腹产术后2h以内的脐带，立即浸泡在4ħ无菌的脐带采集液中。

按Jaffe 法加以改良后进行培养［1，2］。

用0．1%胶原酶消化分离内皮细胞，培养于含有20%胎牛血清（FBS）、青霉素10U/L、链霉素100mg/L的M199液中，37ħ5%CO2培养箱中进行原代培养。

待细胞长成单层后，用0．25%胰蛋白酶消化传代，培养条件同上。

HUVEC经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定阳性，倒置显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列，证实所培养细胞为内皮细胞。

将内皮细胞以2ˑ104/mL细胞接种于96孔塑料培养板中进行培，同时加入不同剂量黄芪注射液（0、40、400、4000μg/
·
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内蒙古医科大学学报2013年2月第35卷第S1期
mL）、TNF（1000U/mL）、TNF（1000U/mL）+黄芪（400μg/mL）连续培养7d。

按不同时间收集培养上清，20ħ保存待测。

1．3．2MTT法检测黄芪注射液对内皮细胞增殖的影响将原代培养的内皮细胞用胰酶+EDTA消化，收集于含有血清的培养液中；细胞计数为5ˑ104/mL；以每孔1ˑ104/mL个细胞接种于8个96孔培养板中，每孔体积200μL，37ħ，5%CO2培养箱中培养24h；待每孔细胞贴壁，换新培养液，加入不同浓度的黄芪注射液（4μg/mL、40μg/mL、400μg/mL、4000μg/mL）；同时将空白对照孔与试验组平行不加细胞只加培养液；每孔总量200ul，每组每个浓度设4个复孔，将培养板移入37ħ含CO2饱和湿度的培养箱培养1 8d；每天取一板，每孔加入MTT（5μg/mL）溶液20ul/孔，37ħ继续培育4h终止培养，吸弃孔内培养上清液；每孔加入200ul DMSO液。

震荡10min，使结晶物充分溶解；选择490nm波长，在酶联免疫检测以上测定各孔光吸收值，记录结果。

以时间为横轴，光吸收值为纵轴制细胞生长曲线。

1．3．3黄芪注射液对内皮细胞增殖周期影响的测定胰蛋白酶0．25%+EDTA消化80% 90%汇合培养细胞，收集入含有20%小牛血清的M199培养液中；离心悬液制成细胞沉积，重悬于生长培养液中，计数；按1ˑ105/mL细胞接种于含有20%小牛血清的M199培养液的25mL的塑料培养瓶中；加无血清培养液继续培养24h后，使细胞处于G0期。

实验分Ⅰ－Ⅴ组，黄芪注射液中浓度分别为4μg/mL、40μg/mL、400μg/mL、4000μg/mL。

吸去无血清培养液，加入含药全培养液，置37ħ，5% CO
2
饱和湿度培养箱中培育12h；常规消化，分别移入试管内，离心清晰细胞，经70%乙醇（4ħ预冷）固定；用PBS液洗涤二次，加RNAase工作液，37ħ避光消化30min；加碘化丙啶（PI）荧光染色工作液，4ħ避光作用30min；上流式细胞仪（美国BD 公司）分析细胞周期各时相比例。

1．3．4VCAM－1和E－selectin的测定采用双抗夹心ELISA法（均按试剂盒说明操作）。

1．4统计学分析
单因素多个样本均数的比较采用One－Way AVOVA法、双因素多个样本均数的比较采用Gen-eralLinear Model GLM Univariate法、同组间两两比较采用AVOVA－LSD法，P＜0．05具有统计学意义。

2结果
2．1内皮细胞鉴定
内皮细胞经FⅧvWF抗体染色后胞浆内显示棕褐色颗粒，（如图1－1）。

透射电镜观察，在少数内皮细胞胞质中可见典型棒状的Weible．Palada小体（如图1－2）。

证实所培养细胞为内皮细胞。

图1－1内皮细胞FⅧ/v WF因子免疫细胞化学染色（ˑ400）
Fig．1－1FⅧ/vWF positive staining of HUVECs（ˑ400
）
图1－2W－P小体（ˑ60000）
Fig．1－2Typical rod－shaped W－P body（ˑ60000）2．2黄芪注射液对培养的人脐静脉内皮细胞增
殖的影响
见图2。

根据内皮细胞生长曲线图形变化，可
见随着培养时间的延长，各组均显示出不同程度的
促生长效应。

经统计学双因素方差分析结果表明
时间和浓度整体方差有差异并且有相互交互性
（Time：F=1079－161，P＜0．05；Concentration：F=
22081－55，P＜0．05；TimeˑConcentration：F
=266．239，P＜0．05）。

实验组与对照组两两比较
结果，在400μg/mL时最为显著（P＜0．05）。

表明
内皮细胞的增殖效应并不随培养液中黄芪注射液
的浓度的增加而增加，而是在400μg/mL时最为显·
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·Journal Of Inner Mongolia Medical University Feb．2013Vol．35No．S1
著，黄芪注射液浓度继续增加时细胞增殖并不显著。

2．3黄芪注射液对内皮细胞增殖周期的影响见图3。

用不同浓度黄芪注射液处理内皮细胞，细胞周期测定结果（见图4A、B、C、D、E）。

正常培养的HUVEC周期中G0/G1期、S期和S+G2/ M期细胞分布比例正常。

经统计学单因素方差分析，G0/G1期、S期和S+G2/M期整体方差有差异（F=41．890，P＜0．05、F=53．457，P＜0．05和F =18．717，P＜0．05），实验组与对照组两两比较结果（P＜0．05），实验组内皮细胞周期各时相的细胞数占细胞总数的百分比与对照组比较有明显的不同。

S期和G2/M期细胞显著增多，而G0/G1期细胞相对比例减少。

黄芪注射液浓度为4μg/mL、40μg/mL、400μg/mL时，处于S+G
2
/M期的内皮细胞比例数显著增高，并以400μg/mL时最为显著；而当其浓度为4000μg/mL时，处于S期和G2/ M期的内皮细胞比例数下降。

提示黄芪注射液具有促进内皮细胞分裂增殖的能力，能明显促进内皮细胞DNA的合成，加快细胞增殖。

其中400μg/mL 的黄芪注射液浓度是促进内皮细胞进入增殖期的最佳浓度。

图2黄芪注射液对HUVECs细胞生长曲线的影响
Fig．2Huangqi injection on growth curve of
HUVECs
图3黄芪注射液对HUVECs细胞增殖周期影响
Fig．3Efect of Huangqi injection on cell－cycle of HUVECs 2．3．1不同浓度黄芪注射液（0μg/mL、40μg/
mL、400μg/mL、4000μg/mL）对HUVECs分泌
VCAM－1的影响见图6。

双因素方差分析结果
显示，内皮细胞在没有黄芪注射液的影响下自然分
泌VCAM－1，在黄芪注射液的影响下分泌的VCAM
－1在不同培养天数之间有显著性差异（F
=364．996，P＜0．05），在不同浓度之间也有显著性
差异（F=1269－635，P＜0．05），两个因素有交互作
用（F=69．286，P＜0．05）。

并当黄芪注射液浓度在
400μg/mL时最为显著，而当其浓度为4000μg/mL
时，内皮细胞分泌的VCAM－1下降。

提示黄芪注
射液具有促进内皮细胞分泌VCAM－1的作用，其
中400μg/mL的黄芪注射液浓度是促进内皮细胞
分泌的VCAM－1的最佳浓度。

2．3．2黄芪注射液（400μg/mL）对TNF－α诱导
的HUVECs分泌VCAM－1的影响（见图7）双因
素方差分析结果表示，黄芪注射液TNF和TNF+黄
芪组间有显著性差异（F=1312－900，P＜0．05），在
不同的培养天数之间也有显著性差（F=3197－
486，P＜0．05），两者具有交互性（F=108．348，P
＜0．05）。

实验组与对照组两两比较，表明黄芪注
射液和TNF均能促进内皮细胞分泌VCAM－1（P
＜0．05），而且黄芪能促进TNF的作用（P＜0．05）。

2．3．3不同浓度黄芪注射液（0μg/mL、40μg/
mL、400μg/mL、4000μg/mL）对HUVECs分泌E－
Selectin的影响我们的实验未能检测到黏附分子
E－selectin。

提示体外培养的内皮细胞在没有任何
刺激的情况下不能分泌E－selectin，黄芪注射液也
不能刺激其分泌E－selectin。

2．3．4黄芪注射液（400μg/mL）对TNF－α诱导
的HUVECs分泌E－Selectin的影响见图8。

双
因素方差分析结果表示，对照组、TNF和TNF+黄
芪组间有显著性差异（F=445．636，P＜0．05），在不
同的培养天数之间也有显著性差（F=94．547，P
＜0．05）并两者之间有交互性（F=25．268，P
＜0．05）。

实验组与对照组两两比较（P＜0．05），表
明TNF能促进内皮细胞分泌E－selectin，而且黄芪
能促进TNF－α的作用（P＜0．05）。

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A（0μg/mL
）B（4μg/mL
）C（40μg/mL
）
D（400μg/mL
）E（4000μg/mL）
图4黄芪注射液对HUVECs细胞增殖周期的影响
Fig．4Effect of Huangqi injection on cell－cycle of
HUVECs
图5VCAM－1测定标准曲线
Fig．5Standard curve of VCAM－1
3讨论
造血是一个复杂的生物学过程，是造血干细胞
在特定造血微环境与某些因素的诱导下增殖分化
为各系成熟血细胞的动态平衡过程。

正常有效的
造血是造血干/祖细胞与骨髓造血微环境（hemo-
poietic microenvironment）之间相互作用的结果。

内
皮细胞是造血微环境的重要基质细胞成分之一。

内皮细胞在血细胞的生成过程的各个环节（如分
化、增殖、成熟）都起着十分重要的作用，可通过以
下方式参与造血过程［3 5］：与造血细胞密切接触而
起到支持和营养造血细胞，为造血细胞的增殖、分
化与成熟构筑良好的空间环境的作用，从而发挥近
距离调节；通过分泌多种刺激因子和抑制因子，从
正、负两方面调节造血以维持机体造血的动态平
衡；内皮细胞分泌多种黏附分子，内皮细胞同时又
是各种细胞因子的受体，在黏附分子的作用下能结
合和聚集外来的因子于局部，形成不细胞因子的不
同浓度分布区，是造血细胞在高浓度的细胞因子的
刺激下增殖分化。

造血干细胞移植是血液系统恶性肿瘤及各种
中晚期恶性实体瘤大剂量化疗或放疗之后骨髓造
血功能衰竭的治疗中的一个不可缺少的重要措施。

造血干/祖细胞归巢分为三个阶段：（1）移植的干
细胞滚动黏附于骨髓血窦内皮细胞（Endothelial
cell，EC）；（2）继之以稳定的黏附并穿行内皮细胞
迁入髓腔；（3）最终与骨髓造血微环境中的基质细
胞和基质相互识别、黏附，通过与骨髓基质细胞产·
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·Journal Of Inner Mongolia Medical University Feb．2013Vol．35No．S1
生细胞因子的选择作用，调节干细胞的生存、增殖、分化并开始重建造血［8］。

内皮细胞在此整个过程中起着重要的作用，黏附分子VCAM－1/VLA－4和E－selectin/皮肤淋巴细胞抗原（CLA）在干/祖细胞归巢中起着关键性作用［6］。

图6黄芪注射射液对HUVECs分泌VCAM－1的影响
Fig．6Efeect of Huangqi injection on VCAM－1production
of
HUVECs
图7黄芪注射液对TNF－α诱导的HUVECs分泌VCAM－1
的影响
Fig．7Effect of Huangqi injection on VCAM－1production of
TNF－αinduced
HUVECs
图8E－selectin测定标准曲线
Fig．8Standard curve of E－
selectin图9黄芪注射液对TNF诱导的HUVECs分泌E－Selectin
的影响
Fig．9Effect of Huangqi injection on E－Selectin production
of HUVECs
G
/G
1
、S和G
2
/M细胞数量比例的变化反映
着细胞增值周期状态，正常内皮细胞增殖率很低，
我们采用流式细胞仪检测到黄芪注射液能够促进
内皮细胞由静止期（G0/G1期）进入增殖期（S+G2/
M期）。

从内皮细胞生长曲线可见，黄芪注射液对
内皮细胞增殖的刺激效应在浓度为400μg/mL时
最为显著，但并不随培养液中黄芪注射液浓度的增
加而增强；当浓度继续增加时，其对内皮细胞增殖
的刺激效应反而逐渐降低。

提示：黄芪注射液中某
些药物成分可促进细胞增殖分裂，并且有其最适药
物浓度。

文献报道，正常时，血管内皮细胞表达ICAM－
1，正常体外培养的内皮细胞不能表达E－selectin，
只有在TNF－α刺激活化的内皮细胞才能表达E－
selectin。

IL－1、IL－4、TNF－α和均能够刺激血管内
皮细胞表达VCAM－1增多［7 9］。

本研究表明，内
皮细胞在体外没有任何刺激的情况下能表达
VCAM－1，但是不能表达E－selectin，这与文献报道
一样。

黄芪注射液能刺激血管内皮细胞的VCAM－
1表达增多，并能与TNF－α有协同作用，但是黄芪
注射液不能直接刺激内皮细胞表达E－selectin，只
有在TNF－α刺激活化的情况下表达，这与文献报
道一致。

但是我们的实验发现，黄芪注射液能促进
TNF－α活化的内皮细胞分泌E－selectin。

本实验
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中400？？g/mL的黄芪注射液是促进内皮细胞黏附分子表达的最佳浓度。

TNF－α在正常人循环中低量表达，TNF－α的生物学活性非常复杂。

TNF－α对不同的细胞有不同的作用。

TNF－α能引起血管内皮细胞结构改变，使其活化，小剂量能诱导血管形成，但是大剂量的TNF－α对内皮细胞有损坏作用。

TNF－α不可逆地抑制红系祖细胞（CFU－E 和BFU－E）地生长．引起红细胞生成减少，破坏增加［10，11］。

TNF－α能诱发GM－CSF、G－CSF、M－CSF、IL－6和IL－1在成纤维细胞和内皮细胞的表达，以及诱发黏附分子在髓性细胞的表达。

TNF－α在体内的作用与细胞因子网络密切相关。

细胞因子之间有许多生物学效应相互重叠，相互促进或相互抑制，细胞因子在体内的效应是这些相互作用的总和。

根据中医“八纲辩证”理论，当机体气血虚（造血功能障碍、大出血、感染）时服用适量的黄芪可起到补气升血的作用［12，13］，但在人体造血是一个动态平衡的过程，机体处于正常情况时服用黄芪不会起到造血旺盛等情况［2］。

我们的实验也提示当体内TNF－α水平增高，抑制造血，对内皮细胞也有损害作用，但同时它还能促进内皮细胞表达黏附分子，以此来达到机体造血平衡的目的，我们外加用适量的黄芪补气可使体内黏附分子水平增高，从而对造血有促进作用。

中医认为，黄芪并不是一个直接生血的药物，而是通过益气来达到生血的作用。

本研究结果提示，黄芪体外造血干/祖细胞似乎并无直接作用，而是通过内皮细胞来发挥作用的。

黄芪能够通过促进内皮细胞的增殖和表面黏附分子的表达及分泌多种细胞因子，将内皮细胞分泌的各种造血细胞因子与细胞外基质结合，构成了一个支持造血的复杂网络，把造血干/祖细胞固定于局部，使干/祖细胞受局部高浓度细胞因子的作用而增殖与分化，这可能是黄芪发挥补气生血的机制之一，也是黄芪参与造血调控的分子基础之一。

造血干/祖细胞与内皮细胞的黏附对造血干/祖细胞归巢中至关重要。

本实验黄芪能够通过促进内皮细胞的增殖和表面黏附分子的表达，将移植进来的造血干/祖细胞稳定的黏附于内皮细胞，并使其顺利通过内皮细胞———髓血屏障，进入造血微环境中，在黏附分子的作用下选择性的黏附在特定的造血区域，使造血干/祖细胞增殖分化。

文献报道黄芪能促进小鼠外周血造血干细胞移植术后早期白细胞的重建。

本实验结果也提示，黄芪通过促进内皮细胞分泌ICAM－1、VCAM－1和E－selectin，可能有促进造血干/祖细胞归巢中的作用。

黄芪在造血干细胞移植中的应用前景尚需进一步研究。

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（4）：593－595
(责任编辑:程立新)
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