液相常见问题

高效液相常见问题
一、色谱分析的准备工作：
在药物分析部门的工作中，对于液相色谱分析工作者而言，进行的药物分析的药物种类或品种时很多的，所以，我们在进行分析工作前，我们要对自己所要进行的药物品种和色谱柱进行统计，尽量做到专药专柱、专柱专用。

这样，我们在进行药物分析和检测工作时，又不会造成色谱柱的交叉污染。

在做到药物分析用的色谱柱专药专柱用之后，可以明确知道该柱的流动相中缓冲液与有机溶剂的配比，快速进行流动相的配制（因为不同厂家和不同型号的色谱柱，即使分离分析同一品种的药物，其流动相的配比都是不尽相同的）。

对于以后流动相的配比能做到有的放矢，也就是说，相对药物的保留时间和流动相的流速也就相对固定了下来。

所以，在之后的相同药物的分析可就能顺手拿来做好了，不存在在以后的试验中还去摸索不同柱子的流动相的配比了。

在以往的试验中，最常出现的情况时，没有做到专柱专用，今天做这药物药调节流动相配比，明天又换根柱子，又是调节流动相配比一番，耗时又缺乏对这种药物分析时的保留时间的不可重现性。

让非专业人员看了觉得不可理解。

同时，对试验者本人来说，也可具有不同时间的试验比较，具有后续试验的参考意义。

二、分析前，对色谱柱的预处理和平衡过程重视。

在每天的实验前，一近实验室，就立即要安排好今天该做的分析工作，连接好今天药物分析所用的专柱，打开色谱泵，用流动相中的相应有机溶剂的含10%
有机溶剂的水溶液进行排气和冲洗色谱柱和管路，冲水30分钟左右，将色谱柱中的纯有机溶剂替换掉，然后再用流动相进行足够时间的平衡，大约1小时左右。

此时，一般来说，色谱柱应该说是够平衡了。

注意在色谱柱平衡半个小时时，打开检测器，在平衡近1小时时，打开色谱工作站，点击查看基线，看基线是否走平直。

在基线走平直后，方可进行分析检测，才能保证检测结果的准确性和保留时间的重复性。

三、分析前的流动相脱气、色谱管路及泵内排气和每天必须要做的事情，否则，在实验过程中，就会造成（1）泵的流速不稳、有时候流速甚至相差甚远，（2）泵压来回波动很大，（3）检测器采集的图像基线很难稳定和走直，出现基线漂移和波动。

（4）色谱峰面积不重现，最麻烦的是好好的色谱峰上突然出项和汽泡锯齿，影响峰面积的读取。

四、色谱分析过程中，一般是采用定量环进行手动进样或者是采用自动进样器进行进样，一般来说，能保证较好的进样量的重现性。

所以在进行进样检测时，关键的步骤时溶液的配制，要做到对照品和待测样品的充分溶解，同时也要充分摇匀，使溶液均有均一性。

六通阀进样器，若采用手动方式，应注意的是：你进样时，是将其从load 位置扳到inject的位置，有的人是采取进样后一分钟左右又将其反扳回至load位置，这种习惯是很好的，因为在load位置，管路不通过定量环，可以减少定量环的承压时间，保护定量环。

但是要注意，你在这分析过程中，你始终要保持相同的处理方式，以保证测量结果的重现性。

在我们的试验分析中，我们采用称量样品和对照品的是：采用干燥
洁净的2mL的小烧杯进行称量，然后小烧杯连同药品一起放在普通漏斗中，将漏斗插入容量瓶，加水或流动相进行溶解，冲洗漏斗和容量瓶，取下漏斗，加水或流动相至刻度，充分摇匀，进行进样分析。

我认为这种称样和溶样方式比用称量纸称量和容样方便和准确。

毕竟称量纸或多或少的具有吸湿性的，影响称量的准确性。

因为在进行液相色谱分析中，药保证分析结果的准确性，称样和容样也是分析结果准确性的关键的一步。

五、在样品的采集和数据或图像结果分析的过程中，要注意的是：因为色谱工作站的处理方式和能力是有限的，因为它只是人脑的机械反应结果。

在色谱工作站的设置上，色谱工作站的积分设置方式都设置有两种：一种是自动积分；一种是手动积分。

这两种积分方式各有其有点，但各也有其不足之处。

对于仪器的自动积分方式，虽然是计分方式是方便，但是你自己去仔细观察，有时候它的积分位置很不准，所以相对来说，它所积分的峰面积结果自然是不准确的了，你若采用这种积分不准确的峰面积结果去进行计算，自然是不准确的。

有时候你会发现，你对某一药物的平行含量分析时，发现两个平行样的结果不平行，有时候不是你的操作引起的，是色谱工作站自动积分不准确的原因。

另一种是手动积分方式，很多人是很提倡这种积分处理方式的，但是这里就存在有对图形和数据的认知的熟练程度，不同的人操作时的结果是有很大出入的。

也就是说这种积分方式的难度就是：随意性大、难以掌控。

我发现很多人甚至是一些制药厂和药检所的人员都还是一味地崇尚于和推崇手动积分方式。

我个人认为：真正的最佳
积分方式是应该将二者有效的结合起来，我以前是推崇手动积分的，但是对于大多数初次使用色谱仪器的使用者和分析检测人员，确实存在一个很难控制的“度”，所以很难做到准确定量结果。

而采用两种积分方式的有效结合，可以很好的掌握这个积分结果的“度”，定量结果也就准确了。

具体的做法是：在色谱工作站上找到仪器参数设置中的积分，将其中的“斜率设置”数值改些，例如，N2000色谱工作站，你就可以将其斜率值设置为合适大小的数值，我一般设置为“4250”左右，它的系统默认值为“70”；SrAdv30色谱工作站，我一般设置为“1250”左右，它的系统默认值为“30”，峰面积的积分结果重现性很好，并且这种通过改动“斜率”的积分方式也是自动的，减少了分析检测人员的手动积分随意性和不确定性，改善了结果的准确性和重现性。

对于某些采用过改动“斜率”的积分方式来积分的积分位置，你认为还不太适当，这时候，你就可以通过少许的手动积分方式处理来进行处理，这时候你的手动积分方式你就拿的准了，因为斜率积分方式已经为你提供了一个手动积分的“度”了。

这个两种积分方式的有效结合使用，是我个人在色谱图想和色谱数据处理上的经验积累，特奉献给同行者，以供参考。

六、在处理色谱数据和试验结果时，学会充分利用计算机软件。

我推崇使用excel计算软件。

将你实验所得的峰面积、样品质量、对照品质量、对照品峰面积、对照品含量输入excel表格，利用excel的函数功能，建立函数表达式，对于每一个实验，你只要输入相应的样品质量和相应峰面积，结果软件立即计算给你计算出来。

这样一来，你
做完实验时，你的分析检测结果也就同时出来，结果准确及时（我已经在我前面博文中有介绍）
七、对于色谱仪器的故障和对策：
1、基线走不直的情况，最主要有以下几个原因：流动相污染或流动相混合不均匀、检测器污染、色谱柱平衡时间不够，走基线时，有时候出现有规律的有相同时间间隔的小尖峰出现，这你可以去查下检测器和色谱工作站的连接是否好，连接不好或接触不良，也出现这种情况的。

还有柱温箱是否打开，也有点影响走基线，不过没前面影响显著。

检测器能量不够等
2、保留时间漂移，主要有以下几个原因：柱温箱没有开启或者是柱温箱温度还没有平衡或柱温箱的恒温功能失常、流动相没有充分平衡色谱柱、泵失常或泵内有气泡，影响流速和泵压，造成流速达不到、色谱柱塌陷造成死体积的增加，影响柱子的分离效果、色谱泵的柱塞杆密封环磨损、管路的些许泄漏等。

3、峰变形，最主要有以下原因：色谱柱筛板会柱头固定相污染造成峰变形的主要因素、流动相配制不正确和流动相被污染。

4、峰平头的情况很简单，主要有：检测器的灵敏度（range）或量程（auxrange）设置过小、进样量过大等。

5、不出峰的情况主要有：流动相配比不正确、有机溶剂太少，出峰时间过长、管路泄漏严重。

6、峰基线平直却无杂质峰且主峰起点垂直上升的主要原因是：进样后没有按检测器的自动调零“autozero”引起。

7、峰面积突然变小的情况主要有：进样器的六通阀堵塞，影响进样量、管路泄露（一般伴随有保留时间增长的现象，好判断）。

8、柱压变大的主要原因：管路过滤器堵塞、色谱柱污染筛板堵塞、检测器污染堵塞、管路堵塞、吸滤器堵塞等，检查的方法是：从检测器段开始检查，采取排除法检查，找出堵塞源。

管路过滤器堵塞、色谱柱污染筛板堵塞、检测器污染堵塞、管路堵塞、吸滤器堵塞采取拆开冲洗的办法进行。

9、柱压突然变小，最常见的原因是：管路泄露或色谱柱连接头松动、色谱泵内突然进入气泡。

10、柱压升不上的主要原因是色谱内存有气泡、单向阀堵塞、柱塞杆损坏或柱塞杆密封环磨损漏气、管路连接松动漏液等。

11、柱压上下来回波动的主要原因：色谱泵内有气泡、单向阀有一个堵塞。

12、检测器自检时出现找不到656nm校正峰时，主要有以下原因：D2灯能量不足、检测器安装D2灯处面板没盖好或关紧好、检测池污染（采取冲洗办法）。

排除以上因素后再按shift+calbium进行重新校正，可能可以通过。

13、对于岛津液相色谱仪器，检测器出现“over”的情况主要是初始值小于0，采取按zero和调剂检测器极性的办法进行排除。

以上是液相色谱仪器使用中最常出现的异常情况，所以介绍这些，仅供参考。

八、做色谱检测分析应具备的良好实验习惯和素质：
1、养成经常不冲洗仪器和色谱柱不罢手的习惯，特别是色谱柱和管路，防止色谱柱污染和管路堵塞。

2、养成流动相滤过和流动相排气的良好习惯。

3、养成定期冲洗管路、冲洗和活化检测池的良好习惯。

4、定期超声清洗管路过滤器的习惯。

5、养成10%甲醇水或乙腈水（40min以上）---色谱甲醇或色谱乙腈（30min以上）的冲洗习惯。

特别是针对反相液相色谱。

6、养成开泵先排气泡的习惯。

7、养成小频度的增加流速的习惯，不要剧升剧降来进行加减流速，以防损坏泵和色谱柱。