免疫检验考试辅导：免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞分离及检测技术
第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。
因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。
血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。
唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
见下图。
图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
免疫细胞的分离和保存技术
第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
第 免疫细胞的分 二 离和保存技术
十
章
何
印
蕾
概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身
免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞 或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用 体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋 巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所 显示的功能的强弱进行检测，是判断机体 细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临 床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情 变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等 方面均有重要意义。
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、 巴 CD25等 细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
(1)E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加 入分层液→T细胞形成E花环而沉 于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙毛分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤 维管→洗脱下来的是T细胞
胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll ) 其密度为1.020。可将血液分成四层， 从上到下依次是：血浆、单个核细胞、 粒细胞和红细胞。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液 密度为：1.135。可将血液分成四层， 从上到下依次是：死亡细胞和血小 板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞。
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
免疫细胞分离的方法及其原理
免疫细胞分离的方法及其原理
免疫细胞分离的方法及其原理：免疫细胞分离是一种利用特定抗体和抗原之间的结合反应，将目标细胞从混合细胞中分离出来的方法。
常见的免疫细胞分离方法包括：
磁珠法：将特定抗体固定在磁珠表面，与目标细胞上的抗原结合后，通过磁力分离出目标细胞。
细胞排序法：利用流式细胞仪或磁珠分选仪，根据目标细胞表面标记物的不同，将目标细胞分离出来。
亲和层析法：将特定抗体固定在固相材料上，通过目标细胞上的抗原与抗体结合，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
免疫细胞分离的原理是利用特定抗体和抗原之间的结合反应，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
在分离过程中，需要选择特异性高、亲和力强的抗体，并在实验过程中控制实验条件，避免非特异性结合或抗体失活等问题。
免疫细胞分离方法在生物医学研究、临床诊断和治疗等领域有着广泛的应用。
15.免疫细胞的分离和检测
方法与原理。
教学内容
1. 免疫细胞的分离与纯化 2. 淋巴细胞的数量检测
3. 淋巴细胞的功能检测
4. 吞噬细胞的功能检测
第一节 免疫细胞的分离与纯化 Separation and Purification of Immunocyte
• 实验的目的；
• 所需细胞的种类、纯度和数量； • 方法简便可行，尽量保持活性、 纯度和收获率。
•
6月20~23日 1.感染免疫及检验
2.肿瘤免疫及免疫学检验
3.移植免疫及免疫检验
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6月30日
实验考试 7月理论考试
第十三章 免疫细胞分离及检测技术 Separation and Assays for Immunocyte
目的要求
掌握免疫细胞分离与纯化的方
法;淋巴细胞、吞噬细胞的功能检测 的方法。熟悉淋巴细胞数量检测的
密度梯度分离单个核细胞 （ Percoll分层液）
三、淋巴细胞的分离与纯化
PBMC悬液富含淋巴细胞，但 有混杂有单核细胞、红细胞和血小 板。
（一）红细胞的去除
无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83% 氯化铵处理法。 （二）血小板的去除
离心洗涤2~3次。
(三） 单核细胞和粒细胞的去除
1. 黏附法
利用二者具黏附玻璃、塑料和 葡聚糖凝胶（Sephhadex G-10)等 特性。95%为淋巴细胞，活性大于 95% 。但损失部分B淋巴细胞。
正常值：60%~80% 小于50%可视为降低
成熟淋巴细胞
转化淋巴细胞
转化淋巴细胞
（二）3H-TdR掺入法
• SI = 刺激管cmp/对照管cmp SI ( stimulation index ) 刺激指数 cmp （每分钟脉冲数） 正常值 SI>2
免疫细胞分离技术
免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是一种重要的生物学和医学研究工具，广泛应用于生物样本中细胞的分离和纯化。
通过利用细胞表面的特异性标记，免疫细胞分离技术可以实现对不同类型细胞的高灵敏度、高特异性的分离。
在免疫学研究领域，免疫细胞分离技术被广泛应用于研究免疫细胞的功能和相互作用，对于深入理解免疫系统的机制具有重要意义。
免疫细胞分离技术的基本原理是利用抗体与特定细胞表面标记结合的高度特异性，通过各种分离方法将该细胞与其他非特异性细胞分离开来。
免疫细胞分离技术通常包括两个关键步骤：抗体与目标细胞的特异性结合和分离纯化。
在抗体结合的过程中，通过将抗体与目标细胞共孵育，使抗体与目标细胞表面标记结合形成抗原-抗体复合物。
而在分离纯化的过程中，可以通过多种方法将抗原-抗体复合物与其他非特异性细胞分离开来，如磁性珠分离、流式细胞仪分离等。
免疫细胞分离技术的关键是选择合适的特异性抗体。
抗体是由机体免疫系统产生的一种高度特异性的蛋白质，具有与目标抗原结合的能力。
在选择抗体时，需要考虑以下几个因素：第一，抗体的特异性；第二，抗体的亲和力和亲和常数；第三，抗体的结合位点；第四，抗体的格式和标记。
合理选择和设计抗体可以提高免疫细胞分离技术的效率和准确性。
在免疫细胞分离技术中，常用的方法之一是磁性珠分离法。
该方法利用表面覆有特定抗体的磁性珠与目标细胞结合，通过磁外场将目标细胞分离出来。
磁性珠分离法具有分离效率高、操作简便、适用范围广等优点，被广泛用于体外培养细胞、临床诊断和基础研究等领域。
另一种常用的免疫细胞分离技术是流式细胞仪分离法。
流式细胞仪是一种高速流动和高灵敏度激光共聚焦技术，可以对单个细胞进行多参数检测和鉴定。
在流式细胞仪分离中，通过合适的荧光染料或荧光标记抗体，结合流式细胞仪对细胞进行定量、快速分析和筛选。
流式细胞仪分离技术具有分离速度快、高通量、对样本体积要求小等优点，广泛应用于细胞表型分析和免疫学研究。
除了磁性珠分离法和流式细胞仪分离法，还有其他依赖于抗体与抗原结合的分离方法，如免疫磁珠分离法、免疫离心法、免疫亲和层析法等。
免疫细胞的分离技术
2
Innate nity 固有免疫
定义：人类在种系进化过程中形成的、经遗传获得 的免疫，遇病原体后首先并迅速起防卫作 用的免疫应答
组成：皮肤、粘膜及其产物、细胞（NK细胞、单 核-吞噬细胞、DC、NKT、中性粒细胞、T 细胞、B1细胞）等
特点：先天具有、无潜伏期、无特异性、无记忆性
作用时间：0-96小时
表达高亲和力IL-2R，介导免疫效应
➢ 记忆T细胞 memory T cells
表达CD45RO，介导再次免疫应答
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T淋巴细胞亚群
• 表达TCR的类型分类 ➢ TCRαβ+ T细胞 ➢ TCRγδ+ T细胞
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T淋巴细胞亚群
• 是否表达CD4或CD8 ➢ CD4+ T细胞 ➢ CD8+ T细胞
CD抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志
13
人CD分组
分组
CD（举例）
T细胞 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、
CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)
B细胞 CD19、CD20、CD21、 CD40、CD79a(Ig)、CD79b (Ig)、
➢ 调节性T细胞Regulatory T cells，Tr
➢ 记忆T细胞Memory T cells，Tm
➢ 抑制性T细胞Suppressor T cells，Ts
27
辅助性T细胞 Helper T cells , Th
➢ Th1: 细胞免疫 ➢ Th2：体液免疫 ➢ Th17：炎症反应
28
辅助性T细胞 Helper T cells , Th
免疫细胞的分离技术
免疫细胞膜分子检测的原理与类型
1、以抗体识别抗原 2、以配体识别受体
免疫细胞膜分子的主要检测方法
1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法
2、补体依赖的细胞毒试验（CDC） 3、花环形成试验
SmIg的荧光抗体检测法
第一节 免疫细胞的分类与分离
一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、细胞的冻存与复苏
免疫细胞的特征
1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性
2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子
免疫细胞的起源与分化
红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞
细胞凋亡的检测方法
1、形态观察法 2、生化检测法 3、流式细胞仪检测法
形态观察法
普通光镜检测——HE染色 甲基绿-派诺宁染色
荧光显微镜检测——溴化丙锭染色
透射电镜检测——典型形态改变
生化检测法
凝胶电泳法 原位末端标记法 二苯胺分光光度法
凝胶电泳法
原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列 （DNA ladder）
流式细胞仪
磁性分离法
磁铁吸引法 N
S
MACS (阴性选择法）
其他分离法
花环沉降法 细胞活化克隆法 MHC分子四聚体法
抗原肽-MHC分子四聚体技术
细胞的冻存与复苏
细胞冻存的原理与方法 细胞复苏的原理与方法
细胞冻存罐
第二节 免疫细胞膜分子的检测
淋
丝裂原（抗原）刺激
巴
细
胞
转
3H-TdR
化
试
验
原
理
项目十六免疫细胞的分离
项目十六免疫细胞的分离一、抗凝血的制备【实验原理】常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固。
实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法。
【试剂和器材】1．试剂肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等。
2．器材三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。
【步骤和方法】1．肝素抗凝法将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115℃灭菌10min(或112℃15min)，置-20℃可保存数月。
实验中常用的肝素抗凝浓度为20~50U/ml血液，实际当肝素浓度为5~10U/ml血液时已显出良好的抗凝效果。
2．EDTA法常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液。
配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解。
用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝。
EDTA-Na2有效抗凝浓度为1~2mg/ml血液。
3．脱纤维法在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放30~40粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。
4．Alsever液抗凝法血液与Aalsever液混合比例为1:1~1:2。
【结果判定】除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备。
【注意事项】1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。
2．加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止。
常采用旋转混合的方法混匀。
3．抗凝血放4℃保存。
【方法评价】肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)。
EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集。
脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少。
Alsever可较长时间保存血液，一般可保存2~3周。
免疫细胞技术
一、免疫细胞分离技术1、淋巴细胞的分离取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min 水平离心20min，管内分为4 层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。
用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。
然后用Hanks 液洗两次，每次2000r／min 离心10min，最后用RPMI l640 培养液将细胞配成2×106／m1 的细胞悬液备用。
2、T 细胞及B 细胞的分离将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B 细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。
然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B 细胞。
尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。
3、CD4 细胞及CD8 细胞的分离（1）CD4 细胞的分离：将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4 细胞。
（2）CD8 细胞分离：用Tris 缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS 洗净。
然后将已标记有抗CD8 单克隆抗体的T 细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿内，4℃放置2 小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS吹打。
收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。
CD4 细胞亦可用此法分离。
4、单核巨噬细胞的分离单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。
免疫细胞的分离技术
免疫细胞的分离技术概述免疫细胞分离技术是生物医学领域中的一项基础技术，它通过对免疫细胞的表面标记进行特异性识别，从而将不同类型的细胞进行有效的分离。
免疫细胞的分离技术在很多疾病的检测、治疗和研究中起着至关重要的作用，如肿瘤学、免疫学、细胞学等领域。
原理免疫细胞的分离技术主要是基于免疫受体（antigen）和特异性抗体之间的作用机制，该过程通常包括三个步骤：细胞表面标记的贴附、特异性抗体的结合和分离。
细胞表面标记的贴附细胞表面标记是指细胞表面上的蛋白或其他化合物，它们能够被抗体所识别。
免疫细胞分离技术中常用的细胞表面标记主要有细胞抗原（cell surface antigen）、细胞特异性蛋白质（cell type-specific protein）等。
特异性抗体的结合特异性抗体是指能够特异性识别并结合到目标物质的抗体。
在免疫细胞分离技术中，特异性抗体与目标细胞表面标记结合后，形成免疫复合物（immunocomplex），从而可以将目标细胞分离出来。
分离在特异性抗体与细胞表面标记结合后，需要利用某种手段将免疫复合物与其他细胞类型分离开来。
目前典型的分离方法包括磁珠分离（magnetic bead separation）、离心分离（centrifugal separation）等。
方法免疫细胞分离技术的具体实施方法可以按照以下步骤进行。
材料准备免疫细胞分离技术需要准备一系列实验材料和试剂，如细胞培养液、特异性抗体、免疫磁珠、离心管、离心机等。
细胞处理将需要分离的细胞进行初步处理，如清洗、培养等。
在细胞处理过程中，需要特别注意避免细胞受到损伤。
抗体结合将特异性抗体与细胞混合，让其发生结合反应。
这一步骤可以在离心管中进行，也可以在培养皿中进行。
分离步骤根据具体的分离方法，选择合适的步骤进行分离，如磁珠分离、离心分离等。
细胞复苏将分离出的细胞进行复苏处理，如使用培养液进行复苏，使其恢复生长和增殖的能力。
应用范围免疫细胞分离技术可以应用于各个领域的研究和应用，涉及以下方面：肿瘤学通过分离出不同类型的癌细胞，可以研究其生长、转化和浸润等机制，并用于肿瘤的诊断和治疗。