松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体的原理及制作方法
多克隆抗体的原理及制作方法一、原理多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。
外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。
初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。
但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。
由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。
记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。
本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。
该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。
二、材料（一）动物选择根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。
动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。
家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。
每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没有明显的损伤。
（二）抗原制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。
常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。
一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。
有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。
多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。
多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
二、试剂生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。
多克隆抗体制备课件
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免疫方式
• 注射途径: 免疫注射的途径也很重要。一般 采用多点注射，一只动物注射总数约为8～ 10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部 两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内 易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有 利
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类 应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。 二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
血液采集
采血量
少量
采血部位
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 •蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合 •抗原亲和纯化 •多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上, 然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体, 然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体, 最后 再将抗体洗脱下来
.鸡Biblioteka 鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保 持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件 下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价 的Fab或Fab′等片段。 鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
多克隆抗体制备和关键技术点
多克隆抗体制备方法和关键技术点抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体（MonoclonalAntibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。
抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。
一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。
只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一种抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。
多克隆抗体是由异源抗原（大分子抗原、半抗原偶联物）刺激机体产生免疫反应，有机体浆细胞分泌的一组免疫球蛋白。
多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。
多克隆抗体的制备
免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、 免疫次数、免疫间隔等因素。
免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动 物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜 过大，以免产生免疫麻痹。 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴 结 等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可 采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二 次免疫的间隔时间尤为重要，一般以10～20天为佳，二次后 间隔时间一般为7～10天，若间隔时间太长，则刺激减弱， 抗体效价不高。
纯度鉴定： 抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、 双向扩散试验、免疫电泳等方法。 IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳 带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗 体混有杂蛋白，需进一步纯化。
结合活性鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、 ELISA或RIA竞争结合试验等。
免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增 强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应 答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： 无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；
生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日 咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰 二肽和细胞因子等；
增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细 胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增 强和扩大免疫应答的效应。
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属 差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或 亲缘关系越近，免疫效果越差。
多克隆抗体制备
③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
精品课件
再次应答(secondary response)
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
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免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
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剂量：免疫（原2）合增适加剂抗原量的的表选面积定；应考虑抗原 性强弱、分（（子34））量佐增大剂强小能辅刺助和激T细免吞胞疫噬的细时作胞用间对；。抗原大的动处物理；
抗原剂量（（以5）蛋刺白激抗致敏原淋为巴准细胞）的约分0裂.和5～浆细1m胞g/
精品课件
鸡
鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可 保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体 的过程称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主要特点为： ①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的 一半； ②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍 到几十倍，而且维持时间长； ③诱发再次应答所需的抗原剂量极小； ④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM 很少，抗体的平均亲和精品课力件 高。如果再次应答
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多克隆抗体的制备
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种 属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系 或亲缘关系越近，免疫效果越差。
人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、 双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全 佐剂、花生油乳剂等；
纳米佐剂
多克隆抗体的制备
弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）
分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊 毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成；
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
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多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
多克隆抗体的制备
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。
抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。
材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mg／ml)；3.消毒酒精及碘酒；4.弗氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
免疫方法1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。
如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。
4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。
效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
多克隆抗体制备流程
多克隆抗体制备流程多克隆抗体制备流程有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选前往丁香实验抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。
抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。
有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。
一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。
抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。
本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
抗原的制备方法
抗原的制备方法
抗原是指能够诱导机体产生免疫应答并能与免疫应答产物（抗体或效应细胞）特异性结合，发生免疫效应的物质。
抗原的制备方法有很多种，下面介绍其中几种常见的方法：
1. 天然抗原的制备：天然抗原是指从自然界中获得的抗原，如病毒、细菌、真菌、寄生虫等。
这些抗原可以通过培养、分离、纯化等方法获得。
2. 人工抗原的制备：人工抗原是指通过人工合成或修饰得到的抗原，如蛋白质、多糖、核酸等。
这些抗原可以通过化学合成、基因工程等方法获得。
3. 基因重组抗原的制备：基因重组抗原是指通过基因重组技术将抗原基因导入宿主细胞中表达得到的抗原。
这种方法可以获得大量的抗原，并且可以对其进行修饰和改造。
4. 合成肽抗原的制备：合成肽抗原是指通过化学合成方法合成的抗原肽段。
这种方法可以获得特定的抗原肽段，并且可以对其进行修饰和改造。
松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备
松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备卞欢;仇新媛;李鹏鹏;陈琳;耿志明;王道营;徐为民【期刊名称】《北京工商大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(036)006【摘要】利用脱氢松香胺( DHAM)为半抗原合成了松香的完全抗原、并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体.首先DHAM与琥珀酸酐( SUC)反应合成琥珀酸单酰脱氢松香胺( DHAM-SUC) ,然后再与牛血清蛋白( BSA)和钥孔血蓝蛋白( KLH)进行偶联,合成了松香的完全抗原DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH,偶联比分别为12和35.以DHAM-SUC-KLH为免疫原对新西兰大白兔进行免疫,制备了抗血清,效价达1. 28 ×105,脱氢松香酸( DHA)和松香酸( AA)的50%抑制浓度(IC50)分别为25. 1滋g/L和36. 4滋g/L.研究合成的松香人工抗原具有理想的免疫原性,获得的多克隆抗体具有较好的灵敏度,可为建立畜禽肉制品中松香残留的酶联免疫吸附分析( ELISA)方法打下基础.【总页数】7页(P51-57)【作者】卞欢;仇新媛;李鹏鹏;陈琳;耿志明;王道营;徐为民【作者单位】江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】TS207.7【相关文献】1.杂环胺人工抗原的合成以及多克隆抗体的制备 [J], 王静;马宁宁;宋洋2.松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备 [J], 卞欢;仇新媛;李鹏鹏;陈琳;耿志明;王道营;徐为民;;;;;;;;;3.胭脂红酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备 [J], 何峰容;杨帆帆;李佳楠4.6-苄基腺嘌呤人工抗原的合成及鼠源多克隆抗体的制备 [J], 孟继秋;胡骁飞;王耀;邢云瑞;曹金博;陈琳琳;孙亚宁;张改平5.巴氯芬人工抗原的合成及其鼠源多克隆抗体的制备 [J], 王耀;李兆周;曹金博;胡骁飞;段张秀;庞杏豪;孟继秋;孙亚宁;曹夕丹;陈秀金因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大田软海绵酸人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备
大田软海绵酸人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备王丽;桑亚新;周群标;王向红【摘要】采用活化酯法将大田软海绵酸(OA)与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备免疫抗原(OA-KLH),用还原聚丙烯酸胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,通过免疫兔子制备抗体,所得抗血清经Protein A凝胶层析柱纯化处理后,用紫外全波长扫描和间接竞争ELISA法验证纯化效果.结果表明,免疫抗原偶联成功并获得了高亲和力的多克隆抗血清,抗血清纯化后浓度为2.16mg/mL,间接竞争ELISA测定其滴度为12800、IC15为3.41ng/ML,为建立快速、经济的检测方法打下了基础.%Okadaic acid (OA) is one kind of lipophilic marine biotoxins, and main pathogenic factor of diarrheic shellfish poisoning (DSP). In this paper, the artificial antigen was made by coupling hapten of OA with keyhole limpet hemocyanin (KLH) using active ester method, and the artificial antigen was tested by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and IR spectrum. After being obtained from rabbits, the antiserum was purified by Chromatography on Protein A Sepharose CL^IB gel column, and the purification efficiency was verified by ultraviolet scanning and ciELISA. The results showed the artificial antigen was prepared successfully and lots of interfering substances were removed. After being purified, the concentration of antiserum was 2.16 mg/mL,it had high titer(12 800)and sensitivity (the value of IC15 was 3.41 ng/mL), which was tested by ciELISA. The success of obtaining polyclonal antibody against OA with high titer and affinity provides the solid foundation which is practical and theoretical for developing rapid and economical detections.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2011(035)007【总页数】7页(P1001-1007)【关键词】大田软海绵酸;人工抗原;红外表征;抗体纯化【作者】王丽;桑亚新;周群标;王向红【作者单位】河北农业大学食品科技学院,河北省农产品加工工程技术研究中心,河北,保定,071001;河北农业大学食品科技学院,河北省农产品加工工程技术研究中心,河北,保定,071001;河北农业大学食品科技学院,河北省农产品加工工程技术研究中心,河北,保定,071001;河北农业大学食品科技学院,河北省农产品加工工程技术研究中心,河北,保定,071001【正文语种】中文【中图分类】Q785;S917近年来全球近岸海域赤潮频发,其危害面积、强度及发生频率均呈上升趋势[1-3],赤潮导致大量产腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)的藻类增殖,如利玛原甲藻(Prorocentrum lima)[4]。
多克隆抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
多克隆抗体的制备
第一节抗原的制备除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。
由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。
一、抗原的提取抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。
根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。
由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。
因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。
如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。
抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。
③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。
现分别简述如下。
（一）材料的选择及预处理选择什么材料主要根据实验目的而定。
通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。
材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。
若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。
某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。
（二）细胞的粉碎除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。
克隆抗体的制备过程
克隆抗体的制备过程引言：克隆抗体技术是一种重要的生物技术手段，可以用于大量生产特定抗体，广泛应用于医学诊断、治疗和生物学研究等领域。
本文将介绍克隆抗体的制备过程，包括抗原选择、免疫动物制备、混合瘤细胞和单克隆抗体的筛选等步骤。
一、抗原选择制备克隆抗体的第一步是选择合适的抗原。
抗原是诱导机体产生免疫应答的物质，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白等。
抗原的选择应考虑到其在研究中的重要性和特异性，同时还要注意抗原的纯度和稳定性。
二、免疫动物制备制备克隆抗体需要使用免疫动物，常见的选择有小鼠、大鼠和兔子等。
免疫动物的选择应根据实验需要和免疫动物的特性进行综合考虑。
免疫动物在免疫前需要进行适当的预处理，如体重控制、适当饲养和健康检查等。
三、抗原免疫将选择的抗原注射到免疫动物体内，引发机体的免疫应答。
免疫的方式可以是皮下注射、腹腔注射或静脉注射等。
在免疫过程中，需要严格控制免疫的剂量和时间，以避免过敏或其他不良反应的发生。
四、免疫增强为了增强抗原的免疫原性，可以使用适当的佐剂，如完全佐剂或不完全佐剂。
佐剂可以提高抗原的免疫原性，促进机体产生更高水平的抗体。
五、细胞融合经过一系列免疫操作后，需要收集免疫动物体内产生的B细胞。
通常采用脾细胞或骨髓细胞作为B细胞的来源。
然后将B细胞与髓瘤细胞融合，形成混合瘤细胞。
六、混合瘤细胞筛选混合瘤细胞具有无限增殖的能力，但不具备产生特异性抗体的能力。
因此，需要对混合瘤细胞进行筛选，筛选出能够产生特异性抗体的单克隆细胞株。
通常采用限稀稀释法或细胞浓度法进行筛选。
七、单克隆抗体制备通过单克隆细胞的培养和扩增，可以获得大量的单克隆细胞。
然后，将单克隆细胞注射到小鼠或裸鼠等动物体内，促使其产生腹水。
腹水中含有大量的单克隆抗体，可以通过离心和纯化等步骤获得纯净的单克隆抗体。
八、单克隆抗体的鉴定和应用获得单克隆抗体后，需要进行其特异性和亲和力的鉴定。
常用的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组化和免疫沉淀等。
克隆抗体的制备过程
克隆抗体的制备过程克隆抗体是一种由单一克隆细胞产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
该技术可以将体内产生的单一种抗体经过克隆扩增，制备大量的同种类抗体，用于生物学和医学等领域的研究应用，所以得到了广泛的应用和重视。
1.抗原制备首先，需要获得目标分子或细胞的抗原物质。
抗原分子可以是蛋白质、多肽、碳水化合物、病毒、细菌、真菌等。
通常，将目标分子充分提取和纯化，以获得高质量的抗原，从而提高制备抗体的效率。
2.免疫动物选取适当的动物，例如小鼠、大鼠、兔子、鸭子等，根据抗原物质的不同，选择适当的动物种类作为抗原注射对象。
在注射之前应先进行动物预处理，使其免疫系统处于兴奋状态；然后再将纯化的抗原注射到动物体内，以诱导免疫系统产生相应的抗体。
3.获得抗血清等待动物产生抗体所需要的时间因动物种类及抗原物质的不同而异，通常需要等待4-8周。
收集动物体内的抗血清，在离心后将清澈的血清收集放置于取代的杯子内备用。
4.制备抗体细胞从动物获得的抗体血清中，分离单一种抗体细胞，可以使用选择性培养基、差速离心等方法来实现。
这样可以得到一个细胞克隆，它们能够制造特异的克隆抗体。
5.细胞培养和收获抗体将细胞进行扩增，并在培养基中提供充足的营养，以促进细胞生长和分裂。
通过特殊方法，可使细胞分泌大量的单克隆抗体。
然后，从培养液中收回分泌单克隆抗体的细胞，分离和纯化抗体，去除污染并提高抗体的纯度。
6.检测抗体的特异性和亲和力检测克隆抗体的特异性和亲和力，通常采用免疫学技术，例如EIA、西方免疫印迹等。
通过这些技术能够确定克隆抗体的特异性和亲和力，保证其质量和稳定性，从而更有效地实现其研究和应用。
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第36卷第6期2018年11月食品科学技术学报Journal of Food Science and TechnologyVol.36No.6Nov.2018 doi:10.3969/j.issn.2095⁃6002.2018.06.008文章编号:2095⁃6002(2018)06⁃0051⁃07引用格式:卞欢,仇新媛,李鹏鹏,等.松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备[J].食品科学技术学报,2018,36(6):51-57.BIAN Huan,QIU Xinyuan,LI Pengpeng,et al.Synthesis of artificial antigens and preparation of multi⁃clonal antibody against rosin[J].Journal of Food Science and Technology,2018,36(6):51-57.松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备卞 欢1, 仇新媛1,2, 李鹏鹏1, 陈 琳1, 耿志明1,*, 王道营1, 徐为民1,3(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;2.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏南京210095)摘 要:利用脱氢松香胺(DHAM)为半抗原合成了松香的完全抗原㊁并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体㊂首先DHAM与琥珀酸酐(SUC)反应合成琥珀酸单酰脱氢松香胺(DHAM⁃SUC),然后再与牛血清蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联,合成了松香的完全抗原DHAM⁃SUC⁃BSA和DHAM⁃SUC⁃KLH,偶联比分别为12和35㊂以DHAM⁃SUC⁃KLH为免疫原对新西兰大白兔进行免疫,制备了抗血清,效价达1.28×105,脱氢松香酸(DHA)和松香酸(AA)的50%抑制浓度(IC50)分别为25.1μg/L和36.4μg/L㊂研究合成的松香人工抗原具有理想的免疫原性,获得的多克隆抗体具有较好的灵敏度,可为建立畜禽肉制品中松香残留的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法打下基础㊂关键词:松香;脱氢松香胺;人工抗原;多克隆抗体;酶联免疫吸附分析方法中图分类号:TS207.7 文献标志码:A收稿日期:20171215基金项目:江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(16)1061)㊂作者简介:卞 欢,男,助理研究员,硕士,主要从事肉品加工与质量控制研究;*耿志明,男,研究员,主要从事食品中化学污染物形成及控制研究,通信作者㊂ 松香是松树含油树脂蒸去松节油后得到的透明固体物质,是用于制造肥皂㊁纸张㊁油漆涂料等的重要化工原料㊂松香主要由松香酸(abietic acid,AA)和脱氢松香酸(dehydroabietic acid,DHA)等组成,按照来源的不同,松香可分为脂松香㊁木松香和浮油松香[1-2]㊂AA和DHA可以导致皮肤过敏,而二者的氧化产物则被认为是主要的致敏物质[3-4]㊂毒理学研究表明,AA和DHA可引起人体肺泡上皮细胞溶解,有损伤DNA的风险[5-9]㊂松香加热熔融后具有良好的黏附特性,曾广泛用于畜禽屠宰,尤其是鸭㊁鹅等水禽屠宰的二次脱毛加工㊂采用松香脱毛加工后,松香主要成分,如AA和DHA,会残留在畜禽表皮组织中,并且难以通过后续的加工(腌制㊁蒸煮㊁烘烤等)有效去除[10-11]㊂2009年,我国颁布‘食品安全法“,禁止在畜禽屠宰加工过程中使用松香二次脱毛㊂但在实际生产中,中小畜禽屠宰企业受利益驱动,违禁使用松香加工畜禽的现象依然十分严重,畜禽屠宰加工中非法使用松香脱毛的现象屡有媒体曝光,松香残留导致的质量安全隐患已引起社会关注㊂因此,建立健全并推广实施畜禽肉制品中松香残留的检测方法,对于监测流通领域畜禽肉制品中松香残留水平㊁规范畜禽屠宰加工具有重要意义㊂AA和DHA广泛存在于造纸厂的废水中[12],在日用消费品,如药剂[13]㊁化妆品[14]等中也常有检出,甚至可以通过包装材料迁移进入食品中[15]㊂15AA 和DHA 的检测方法主要有气相色谱法(GC)[16-17]㊁高效液相色谱法(HPLC)[2,13,18-20]以及液相色谱质谱法(LC⁃MS)[21-22]㊂相对而言,基于HPLC 的分析方法应用更为普遍㊂针对畜禽肉制品中存在的松香残留,国内学者也已建立了基于HPLC 的分析方法,并对流通领域内的白条鸭㊁猪头(爪)及其熟制品中的AA 和DHA 进行了调查,结果表明生熟畜禽肉制品,尤其是水禽肉制品中松香残留的检出阳性率以及含量确实值得关注[10-11,23-25]㊂酶联免疫吸附分析(enzyme linked immunosor⁃bent assay,ELISA)技术具有简便㊁快捷㊁通量高等优点,广泛应用于化学污染物的快速分析中㊂松香主要成分AA 和DHA 都是小分子化学物质,不具备免疫原性,目前国内外均未见松香残留的人工抗原合成㊁多克隆抗体制备以及相关ELISA 的研究报道㊂本文以脱氢松香胺(dehydrobietylamine,DHAM)半抗原,通过琥珀酸酐(succinic anhydride,SUC)酰化后分别与牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)和钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin,KLH)偶联,合成㊁表征了人工抗原(合成路线见图1)㊂在此基础上通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,希望为进一步建立畜禽加工肉制品中松香残留的ELISA 方法打下基础㊂图1 以DHAM 为原料合成抗原的示意图Fig.1 Scheme for synthesis of antigens from DHAM1 材料与方法1.1 材料与试剂脱氢松香胺㊁脱氢松香酸㊁松香酸㊁琥珀酸酐㊁牛血清蛋白㊁钥孔血蓝蛋白购自北京百灵威科技有限公司;弗氏完全佐剂购自美国Sigma 公司;HRP 羊抗兔IgG 购自南京巴傲得生物科技有限公司;其余化学试剂均为分析纯,实验用水由美国Millipore 公司纯水仪制备㊂新西兰大白兔由江苏省农科院动物免疫工程研究所提供㊂1.2 仪器与设备Nicolet iS50型傅立叶变换红外光谱仪,美国Thermofisher 公司;Avance 400型核磁共振波谱仪,瑞士Bruck 公司;1260/6420A 型高效液相色谱法串联质谱分析仪,美国Agilent 公司;LS55型荧光分光光度仪,美国PerkinElmer 公司;Epoch 型微孔板分光光度仪,美国Bioteck 公司;UV1100型紫外可见分光光度计,上海美普达公司㊂1.3 实验方法1.3.1 DHAM⁃SUC 的合成DHAM(285mg,1.0mmol)和SUC(120mg,1.2mmol)溶于10mL 无水吡啶,在室温下搅拌24h㊂反应混合物中加入20mL 水,然后用50mL 乙酸乙酯萃取2次㊂有机相用水洗并用硫酸镁干燥,旋转蒸发除去溶剂,粗产物用硅胶柱净化,用乙酸乙酯正己烷(V /V =3∶2,φ=0.1%的乙酸)洗脱,洗脱液旋转蒸发获得灰白色琥珀酰脱氢松香胺(DHAM⁃SUC),用红外光谱(IR),核磁共振(1H NMR)以及质谱(ESI⁃MS)进行表征㊂1.3.2 DHAM⁃SUC⁃BSA 和DHAM⁃SUC⁃KLH 的合成DHAM⁃SUC(38.5mg,0.10mmol)溶于10mL无水二恶烷,然后加入三丁胺(28.5μL,0.12mmol)和氯甲酸叔丁酯(16.4μL,0.12mmol),室温下搅拌1h㊂反应混合物滴加入BSA(660mg,0.01mmol)的Tris 缓冲溶液(20mL,pH =8.8),4℃条件下搅拌过夜㊂将制得的半抗原蛋白偶联物溶液转移至透析袋,在超纯水中透析24h,期间更换4次超纯水25食品科学技术学报 2018年11月(2L)㊂透析的溶液冻干获得白色泡沫状DHAM⁃SUC⁃BSA(516mg)㊂同法合成DHAM⁃SUC⁃KLH,其中KLH用量为80mg(2×10-5mmol)㊂用荧光光谱表征DHAM⁃SUC⁃BSA和DHAM⁃SUC⁃KLH㊂1.3.3 DHAM⁃SUC⁃BSA和DHAM⁃SUC⁃KLH偶联比的测定完全抗原偶联比的测定参考文献[26],并略做修改,简述如下:以L⁃缬氨酸作为活性氨基的标准物质,用ω=4%的Na2CO3水溶液配制系列L⁃缬氨酸标准溶液,然后与ω=0.1%的三硝基苯磺酸(TN⁃BS)溶液混匀,40℃恒温水浴避光反应2h,于420 nm处测定吸光值(OD420),建立标准曲线;分别称取适量的载体蛋白和完全抗原,操作同上㊂按式(1)计算完全抗原偶联比㊂人工抗原偶联比=(C A/m1-C B/m2)×V×M×10-6,(1)其中,C A㊁C B分别为载体蛋白和完全抗原溶液的活性氨基,μmol/L;m1㊁m2分别为载体蛋白和完全抗原的称样质量,mg;V为溶解载体蛋白和人工抗原的溶液体积,mL;M为载体蛋白的分子量,KLH为4.0×105Da,BSA为6.6×104Da㊂1.3.4 免疫实验新西兰大白兔5只,其中4只皮下注射2.0 mL的DHAM⁃SUC⁃KLH(1.75mg溶于1.0mL含有0.25mL DMSO的PBS,然后用1.25mL弗氏完全佐剂乳化),另一只用KLH代替DHAM⁃SUC⁃KLH进行免疫,作为阴性对照㊂在第21㊁38和50天,每只新西兰大白兔采血10mL观察抗体产生情况㊂每次采血同时,肌肉注射1.0mL的DHAM⁃SUC⁃KLH(1.0mg溶于0.5mL含有0.25mL DMSO的PBS,然后用0.75mL弗氏完全佐剂乳化)㊂抗血清滴度采用间接ELISA测定,其中DHAM⁃SUC⁃BSA用作包被抗原㊂最后一次注射后7d,每只新西兰大白兔心脏采血,离心去除细胞后收集抗血清,-80℃保存㊂1.3.5 间接ELISA测定抗血清效价新西兰大白兔最后一次免疫7d后采血测定其抗血清效价,方法如下㊂以2μg/mL的抗原(DHAM⁃SUC⁃BSA)包被96孔酶标板(包被液为pH 值9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液),每孔100μL, 4℃过夜,用磷酸盐吐温缓冲液(PBST,pH值7.4)洗板3次;以w=5%脱脂乳(溶于PBST)进行封闭,每孔100μL,37℃放置1h,PBST洗板3次;加入倍比稀释的待检血清(采用w=2%脱脂乳稀释),每孔100μL,37℃放置1h,洗板3次;加入一定稀释度的HRP羊抗兔IgG(采用w=2%脱脂乳稀释),每孔100μL,37℃放置1h,PBST洗板3次;加入四甲基联苯胺(TMB)底物溶液,每孔100μL,37℃显色5 min;每孔加入2mol/L H2SO450μL,终止反应;用酶标仪测定OD450值㊂以S/N≥2.1所对应的最大稀释倍数为阳性血清的抗体效价,其中S为阳性血清的OD450,N为阴性血清的OD450㊂1.3.6 抗血清与DHA和AA反应灵敏度的初步评价采用间接竞争ELISA评价抗血清与DHA和AA 反应灵敏度,方法如下㊂根据1.3.5节的结果,将OD450在1.0左右的抗体稀释倍数作为抗血清的稀释倍数,添加系列DHA或AA标准溶液(1~500μg/L),参照1.3.5节测定OD450,按式(2)计算抑制率㊂抑制率=[(A0-A)/A0]×100%,(2)其中A为DHA或AA标准溶液(1~500μg/L)的吸光值,A0为未添加标准溶液的吸光值㊂以标准溶液浓度对数值为横坐标,抑制率为纵坐标,建立回归方程,分别计算DHA和AA的50%抑制浓度(IC50)和20%抑制浓度(IC20)㊂2 结果与讨论图2 半抗原DHAM⁃SUC的红外光谱Fig.2 IR spectrum of DHAM⁃SUC2.1 DHAM⁃SUC的鉴定结果分别用红外光谱(IR)㊁核磁共振(1H NMR)以及质谱(ESI⁃MS)对合成的半抗原DHAM⁃SUC进行鉴定㊂其中IR(CHCl3)νmax1716和1697cm-1为酰胺的=C O特征红外吸收峰(见图2);1H NMR(CDCl3,35第36卷第6期 卞 欢等:松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备400MHz)δ6.0(t,J =2Hz,1H,N H)为酰胺的N H 特征质子峰(见图3);负离子模式下ESI⁃MS 中m /z 384.3和m /z 769.7分别为DHAM⁃SUC 的(分子量385.3)[M⁃H]-和[2M⁃H]-(见图4)㊂以上结果证明DHAM 和SUC 的酰化反应获得成功㊂图3 半抗原DHAM⁃SUC 的1H NMR 图Fig.3 1H NMR spectrum of DHAM⁃SUC图4 半抗原DHAM⁃SUC 的质谱Fig.4 ESI mass spectrum of DHAM⁃SUC2.2 完全抗原的鉴定结果为了观察DHAM⁃SUC 和BSA㊁KLH 的偶联,本文比较了偶联前后BSA㊁KLH 的荧光光谱(图5和图6)㊂完全抗原DHAM⁃SUC⁃BSA 和DHAM⁃SUC⁃KLH 的荧光强度均显著低于相同蛋白浓度的BSA 和KLH㊂半抗原DHAM⁃SUC 通过羧基与BSA 和KLH 上的游离伯氨基发生反应,导致蛋白上的游离胺基数减少,导致偶联蛋白的荧光强度下降,但几乎不改变其最大发射波长[27]㊂蛋白偶联前后的荧光光谱表明,半抗原已与BSA 和KLH 成功偶联㊂运用三硝基苯磺酸法测定偶联前后蛋白的游离氨基数,计算偶联比,结果显示DHAM⁃SUC⁃BSA 和DHAM⁃SUC⁃KLH 的偶联比分别为12和35㊂蛋白质的质量浓度:BSA 及完全抗原浓度均为20μg /mL;激发波长225nm;扫描250~450nm㊂图5 BSA 和DHAM⁃SUC⁃BSA 的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of BSA and DHAM⁃SUC⁃BSA2.3 抗体的效价分析最后一次免疫7d 后,4号新西兰大白兔抗血清的效价达到了1.28×105,其余也达到了6.4×104㊂表明本文制备的完全抗原具有良好的免疫原性㊂45食品科学技术学报 2018年11月蛋白质的质量浓度:KLH 及完全抗原浓度均为0.2mg /mL;激发波长225nm;扫描250~450nm㊂图6 KLH 和DHAM⁃SUC⁃KLH 的荧光光谱Fig.6 Fluorescence spectra of KLH and DHAM⁃SUC⁃KLH2.4 抗体与脱氢松香酸和松香酸反应的灵敏度分析为了初步了解抗血清对松香主要成分DHA 和AA 的灵敏度,本文在固定包被抗原浓度(2μg /mL)和抗血清稀释倍数(3.2×104)的条件下,利用4号新西兰大白兔的抗血清分别观察了DHA 和AA 的抑制率和浓度对数的关系(见图7)㊂其中DHA 的回归方程为y =32.23x +4.85(R 2=0.9939),IC 50为25.1μg /L,IC 20为3.0μg /L;AA 的回归方程为y =3.49x +2.45(R 2=0.9949),IC 50为36.4μg /L,IC 20为5.4μg /L㊂以IC 20作为检测限和常见的仪器分析方法比较,4号新西兰大白兔的抗血清对DAH 和AA 的灵敏度已显著优于基于GC [16-17]和HPLC [18-20]的方法,与LC⁃MS 分析方法[21-22]相当㊂图7 间接竞争ELISA 测得的DHA 和AA 的抑制曲线Fig.7 Inhibition curves for DHA and AA usingindirect competitive ELISA松香的主要成分AA 和DHA,不具备免疫原性㊂本文曾利用亚硫酰氯法将DHA 直接与BSA 和KLH 偶联,成功合成并表征了DHA⁃BSA 以及DHA⁃KLH (数据未列出),并将DHA⁃KLH 作为免疫抗原对兔子进行了免疫,但是未能成功获得高效价的抗血清㊂我们认为DHA⁃KLH 可能在兔子体内发生了分解,失去了免疫原性㊂DHAM 虽然不是松香的成分,但与松香的主要成分DHA 和AA 的化学结构高度相似㊂本文利用DHAM 上的伯氨基可以在温和条件下与羧基形成酰胺的特点,将DHAM 经过琥珀酸与载体蛋白偶联㊂运用DHAM⁃SUC⁃KLH 作为免疫原㊁免疫新西兰大白兔产生了具有理想效价的抗血清㊂免疫获得的抗血清对松香主要成分DHA 和AA 均具有理想的灵敏度,为下一步建立畜禽肉制品中松香残留ELISA 方法的建立打下了坚实的基础㊂3 结 论本文利用DHAM 为半抗原㊁经过琥珀酰化与BSA 和KLH 偶联,成功合成了松香的完全抗原DHAM⁃SUC⁃BSA 和DHAM⁃SUC⁃KLH,并以DHAM⁃SUC⁃KLH 为免疫原对家兔进行了免疫,获得了抗血清,效价达1.28×105㊂运用间接竞争ELISA,对DHA㊁AA 的抑制率进行了初步研究,IC 50分别为25.1μg /L 和36.4μg /L㊂本文的创新点是以DHAM 半抗原合成松香人工抗原,并制备多克隆抗体,为进一步建立畜禽肉制品中松香残留的ELISA 分析方法打下了基础㊂参考文献:[1] ERIKSSON K,WIKLUND L,LARSSON C.Dermal ex⁃posure to terpenic resin acids in Swedish carpentry work⁃shops and sawmills [J].Annals of Occupational Hy⁃giene,2004,48:267-275.[2] SADHRA S,GRAY C N,FOULDS I S.High⁃perform⁃ance liquid chromatography of unmodified rosin and itsapplications in contact dermatology [J].Journal of Chro⁃matography B,1997,700:101-110.[3] KARLBERG A T,BOMAN A,HACKSELL U,et al.Contact allergy to dehydroabietic acid derivatives isolatedfrom Portuguese colophony [J ].Contact Dermatitis,1988,19:166-174.[4] SMITH P A,GARDNER D R,DROWN D B,et al.De⁃tection of resin acid compounds in airborne particulate generated from 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