基因克隆-4基因剔除

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基因克隆(包括DNA提取技术步骤)

基因克隆(包括DNA提取技术步骤)

基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接,然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程,又称为重组DNA技术。

DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术,如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。

一 DNA的提取二目的DNA片段的获得(酶切)三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液:1 准备1.5ml离心管,加入500ul裂解液,取组织放入离心管,破碎。

(常温操作)2 恒温箱裂解,55℃。

30min。

3 加等体积Tris饱和酚(酚:氯仿:异戊醇25:24:1),先颠倒混匀后静置抽提10分钟,离心4度12000g 10分钟。

(注意酚在油层下面)4 取上清(把枪头去掉部分,注意液面。

蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中),加入等体积CI(氯仿:异戊醇24:1),先颠倒混匀后静置抽提10分钟,离心4度12000g 10分钟。

5 汇集上清,加2倍无水乙醇(-30度保存),颠倒混匀可观察到絮状DNA。

在-30度冰箱沉淀30min。

离心4度12000g 10分钟。

6 弃去上清,75%乙醇洗涤,7500g离心5分钟。

7 重复一次上述操作。

7 在无菌台干燥半小时,乙醇挥发。

8 溶解于200ulddwater。

9 定量DNA。

裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA(PH=8.0高压灭菌。

作用抑制酶的活性。

)螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。

50ul 10%SDS(蛋白质变性剂)10ul 1MTris-cl(PH=8.0高压灭菌)缓冲溶液5ul PK(消化)735ul 灭菌超纯水EDTA(0.5 M,pH8.0)将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na.2H2O)加入800ml水中,在磁力搅拌器上剧烈搅拌。

分子生物学 名词解释

分子生物学 名词解释

名词解释1. 基因(gene):2. 结构基因(structural gene):3. 断裂基因(split gene):4. 外显子(exon):5. 内含子(intron):6. 多顺反子RNA(polycistronic/multicistronic RNA):7. 单顺反子RNA(monocistronic RNA):8. 核不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA, hnRNA):9. 开放阅读框(open reading frame, ORF):10. 密码子(codon):11. 反密码子(anticodon):12. 顺式作用元件(cis-acting element):13. 启动子(promoter):14. 增强子(enhancer):15. 核酶(ribozyme)16. 核内小分子RNA(small nuclear RNA, snRNA)17. 信号识别颗粒(signal recognition particle, SRP)18. 上游启动子元件(upstream promoter element)19. 同义突变(same sense mutation)20. 错义突变(missense mutation)21. 无义突变(nonsense mutation)22. 移码突变(frame-shifting mutation)23. 转换(transition)24. 颠换(transversion)(三)简答题1. 顺式作用元件如何发挥转录调控作用?2. 比较原核细胞和真核细胞mRNA的异同。

3. 说明tRNA分子的结构特点及其与功能的关系。

4. 如何认识和利用核酶?5. 若某一基因的外显子发生一处颠换,对该基因表达产物的结构和功能有什么影响?6. 举例说明基因突变如何导致疾病。

(四)论述题1. 真核生物基因中的非编码序列有何意义?2. 比较一般的真核生物基因与其转录初级产物、转录成熟产物的异同之处。

基因工程的基本操作过程

基因工程的基本操作过程

1
DNA提取
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
从细胞中提取目标DNA。
2
DNA克隆
将目标DNA插入载体质粒中进行复制。
3
转化
将质粒DNA导入到细胞内。
4
转录
产生RNA分子。
5
翻译
通过翻译机制形成蛋白质。
常见的基因工程技术
质粒构建
将目标DNA插入载体质粒中进行克隆。
基因敲除
在生物体的基因组中“删掉”特定的基因, 观察其对生命活动的影响。
结论
基因工程技术是一项革命性的技术,它不仅带来了许多前所未有的机遇,也 需要我们面对许多伦理问题和考虑。希望我们能够在伦理的框架内,发挥人 类创新智慧,实现科技与人类社会的共同进步。
基因工程的基本操作过程
基因工程是一项将DNA分离、克隆、转化、转录、翻译和表达的技术。这项 技术有着广泛的应用,涉及到农业、医学、工业和环保等领域。
基因工程的定义
基因工程是指通过改变生物的遗传信息,来实现某种特定目的的技术。它的目的是将有用的遗传 信息从一个生物体传递到另一个生物体。
基因工程的基本步骤
通过基因工程技术,可以在大肠杆菌、酵母 等生物中实现目的蛋白的大规模制备,具有 重要的经济价值。
环境领域
基因工程技术在污染治理和资源利用方面具 有巨大的潜力,如利用微生物降解污染物, 通过植物修复土壤等。
伦理问题与考虑
基因工程技术不仅给人类带来了前所未有的发展机遇,同时也带来了一系列 伦理问题和考虑,例如修饰人类基因、人类克隆等等。
基因突变
通过人工干预改变基因序列,使其产生不 同作用。
基因编辑
通过CRISPR等技术精准地修改基因序列, 使自然界中不存在的基因发生。

巴斯德 [巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌]

巴斯德 [巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌]

3.2 毕赤酵母的高效转化及检测
验,按电泳条带亮度比较 PEP4 基因剔除前后毕赤酵母 MIP 的表达量,并
用 EcoRI 酶切质粒 pRS306/PEP4 L&R。由电泳结果可见,酶切后呈现
统计试验结果。
单一条带,酶切完全,见图 5。转化后在 SC-ura 平板上得到期望的转化
子。PCR 检测结果说明,置换前片段约为 1.7 kb,置换后片段约为 4.8 kb,
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pRS306/PEP4L&R 进行转化,涂 SC-ura 平板,挑取单克隆在 YPD 培育基上
3 结果与商议
连CR 检测,根
据 DNA 片段大小判定毕赤酵母 PEP4 基因是否剔除〔置换前片段约为 1.7
激活液泡蛋白酶。在缺乏蛋白质水解酶 A 的状况下,有活性的蛋白质水解
巴斯德毕赤酵母〔Pichia pastoris〕是较理想的外源基因表达系统 酶 B 仍能在几个细胞生长周期内继续激活液泡蛋白酶,但蛋白质水解酶 B
[1]。在外源蛋白质的表达过程中,宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有确 的自我激活能力并不是无限的,一旦其活性降低到某一临界值以下,细胞
3.1 构件质粒 pRS306/PEP4 L&R
kbp,置换后片段约为 4.8 kbp〕,并对 PCR 扩增得到的 DNA 片段测序。
3.1.1PCR 扩增 DNA 片段的鉴定 PCR 扩增 221 bp 毕赤酵母 PEP4 基因
将单菌落摇瓶培育后,依据羧肽酶 Y 平板检测法[10]鉴定 CPY 活性。 左臂和 225 bp 右臂 DNA 片段后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,说明其大小与
1.2 培育基

转基因、基因克隆与基因敲除技术

转基因、基因克隆与基因敲除技术

内切酶消化 线性化打靶载体
打靶载体
转染 基因组
纯合子小鼠 (基因剔除)
兄妹交配
杂合子小鼠
同源重组
正常小鼠
交配
杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
植入
胚泡
假孕小鼠
黑色雌性大鼠
B 、 制 备 基 因 敲 除 动 物 ( 小 鼠 )
来自褐色大鼠
1、Neor (neomycin-resistance gene)基因:阳性 筛选标志,使细胞具有抵抗新霉素(G418)能力。
1号发生位点同源重组,在G418培养基中生长;
2号为随机插入重组,带入tk基因,可在G418培养基中生长,但 在gangcyclovir培养基中被杀死;
3号未发生任何重组,为正常细胞,在G418培养基中被杀死。
抵抗G418的基因 1 2 tk基因 3
B、制备基因敲除动物(小鼠)
1、将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡 中(形成嵌合体胚胎,两套基因物质) 2、将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。 3、诞生出杂合的嵌合体小鼠,具黑毛和褐色毛,胚胎干细 胞来自褐色小鼠,正常胚胎来自黑色小鼠。 4、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配,产生纯黑色与纯褐色 的后代小鼠,其纯褐色小鼠为杂合子,有一目的基因已被敲 除。 5、近亲交配,产生纯合子基因敲除小鼠(第四代)。
G418(也称遗传霉素)是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉 素、庆大霉素、卡那霉素相似,它通过影响80S核糖体功能而阻 断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、 植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常 用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方 后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产 物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性 ,已在基 因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应 用。

基因工程四大步骤

基因工程四大步骤

基因工程四大步骤基因工程四大步骤基因工程是一种利用先进的技术和手段对生物基因进行修改和改造的科学,它的应用范围非常广泛,包括医学、农业、环境生态等多个领域。

它的实现离不开四个重要步骤:基因分离、基因克隆、基因编辑和基因导入。

下面分别介绍这四个步骤的实现过程和应用。

一、基因分离基因分离是指从细胞中将目标基因剪切下来并独立分离出来的过程。

一般来说,基因分离是在DNA分子水平上进行的。

基因分离可通过不同的方法实现,最常用的方法是PCR技术。

PCR是指在特定条件下将DNA进行反复扩增的技术,通过PCR可以快速而准确地从DNA分子中扩增出目标片段,从而实现基因分离。

基因分离的应用范围很广泛。

在医学领域中,基因分离可以用于检测基因缺陷和研究基因突变的原因。

在农业领域中,基因分离可以用于筛选优良品种的种质资源。

同时,通过基因分离可以制备基因库,为基因克隆提供充足的物质基础。

二、基因克隆基因克隆是指将目标基因插入到载体DNA分子中,从而形成重组DNA分子的过程。

基因克隆是基因工程中最基本的技术之一,也是实现其他基因工程技术的前提。

基因克隆的过程中,需要选择合适的载体,将其剪切开来,并将目标基因插入到其中,最后再将重组DNA转化到宿主细胞中,从而实现基因克隆。

基因克隆的应用非常广泛。

在医学领域中,基因克隆可以用于制备大量的重组蛋白,在药物研发中有着重要的作用。

在农业领域中,基因克隆可以用于制备抗病虫害的转基因作物种子,以提高作物产量和品质。

三、基因编辑基因编辑是指利用CRISPR-Cas9等技术对基因进行人为的修改和编辑的过程。

基因编辑可以实现对基因序列的任意精确编辑,甚至可以实现对基因的精确修复和替换。

因此,基因编辑技术被广泛应用于疾病治疗、种质改良、基因功能研究等领域。

基因编辑的应用范围非常广泛。

在医学领域中,基因编辑可以用于疾病治疗和基因治疗。

在农业领域中,基因编辑可以用于创新种质、改良农产品品质、提高作物耐逆性。

分子生物学技术在育种中的应用

分子生物学技术在育种中的应用

分子生物学技术在育种中的应用随着人类对农业生产的要求越来越高,育种技术也逐步得到了广泛应用。

分子生物学技术作为一种新兴的技术手段,已经成功地应用于育种领域,如品种评价、基因克隆、基因工程等。

这篇文章就会从分子生物学技术在育种中的应用、育种中的分子标记技术、基因工程在育种中的应用等来进行探讨。

一、分子生物学技术在育种中的应用分子生物学技术包含了基因分析、基因克隆、基因工程等多个方面。

它们在育种中的应用非常广泛,以基因分析和基因克隆在育种中的应用为例,它们在不同的领域中都有着广泛的应用。

基因分析是利用现代分子生物学技术,研究生物体中的基因信息,包括基因组分析、表达分析和功能分析。

它可以揭示物种遗传信息、生命过程和相互作用的细节,对于育种人员挖掘新的优良基因,提高育种的效率和成功率等方面都有着非常重要的作用。

利用基因分析技术可以对目标基因进行鉴定,从而在重点育种过程中减少时间和费用的浪费,提高育种的准确性和效率。

另外,分子生物学技术还可以通过分析生物体的基因表达情况,了解基因的功能、调控机制和代谢途径等,为深入挖掘品种的优异性提供了技术支持。

二、育种中的分子标记技术育种中的分子标记技术是利用人工合成的DNA(脱氧核糖核酸)序列,对物种内部的个体、族群和种群进行鉴别定位、分类检测和遗传分析的一种新技术。

它不仅可以帮助育种人员更好地选择和筛选适宜育种的样本,还可以了解育种的遗传结构和遗传多样性,启发育种人员从多方面和多角度考虑优化方案,优化生产模式,以达到更优的育种结果和更高的产量。

分子标记技术的种类非常多,但最常用的包含简单重复序列、RFLP(限制性片段长度多态性)和SSR(简单序列重复)等。

其中,RFLP技术的操作繁琐,数据处理困难,而SSR标记技术在样本量不多时更为适用,其次是AFLP(扩增性片段长度多态性)技术,常用于检测物种整体DNA亲缘关系模式。

分子标记技术的应用对于育种有着非常重要的意义。

一方面,可以使用分子标记技术对育种中产生的新品种进行评价和筛选;另一方面,利用分子标记技术可以有效实施父本和母本的配合性能控制以及新品种组合的选定,从而大大提高育种效率和成功率。

12基因工程的基本操作

12基因工程的基本操作

12基因工程的基本操作基因工程是一种应用基因学原理和技术,对生物体的基因进行人为操作的科学与技术。

基因工程的基本操作主要包括基因克隆、基因组重组、基因敲除、基因敲入等。

1.基因克隆:基因克隆是将感兴趣的基因从生物体中分离出来,并在其他生物体或者系统中重新表达的过程。

克隆过程中,需要提取DNA,利用限制酶切剪目的基因,再通过连接酶将目的基因与载体连接,最后将重组体转化至宿主生物体中。

2.载体选择:在基因工程中,选择合适的载体是非常重要的。

例子包括质粒、病毒和人工染色体等。

质粒是常用的载体,可以用于表达基因、扩增基因,以及将基因转移到其他生物体中。

3.DNA扩增:DNA扩增是一种将目标DNA序列放大的技术。

聚合酶链反应(PCR)是最常用的DNA扩增技术,它能够快速、准确地扩增特定DNA片段。

4.DNA合成:DNA合成是基因工程中的关键步骤之一、合成DNA可以利用重复周期形成新的DNA链。

常用的DNA合成方法有在体合成(化学合成)和原核合成(利用DNA聚合酶)两种。

5.基因组重组:通过将DNA片段重组到新的顺序中,进行基因组重组。

例如,将人类基因组片段插入到小鼠基因组中,从而制造出含有特定人类基因的转基因小鼠。

7.基因敲入:将新的基因插入到生物体的基因组中,以研究其功能或产生特定表型。

例如,将草莓和鲜红番茄基因结合,使得番茄具有草莓般的颜色和味道。

8.多基因连锁:将多个基因重组在一起,形成多基因连锁,以实现特定功能或表型。

9.基因甄别:在基因工程中,基因甄别是一个重要的步骤,用于确认克隆的基因是否为目标基因以及其是否被正确插入。

10.转基因:转基因是指将外来基因导入生物体,从而改变其性状或功能。

常见的转基因作物包括转基因玉米、大豆和棉花。

11.基因表达:基因表达是指将目标基因从DNA表达为蛋白质。

通过转录和翻译的过程,基因的信息被转化为蛋白质的结构和功能。

12.基因嵌入:将目标基因嵌入到宿主基因组中的特定位点。

选择性基因剔除的原理是

选择性基因剔除的原理是

选择性基因剔除的原理是
通过特定的技术手段,将特定基因的表达被抑制或失活,进而使该基因在个体发育或功能中的作用被消除或减弱。

选择性基因剔除的原理可以有多种方式,其中常用的包括:
1. 基因敲除(Gene knockout):通过将靶向的基因进行敲除,使其在个体中丧失功能。

这一方法常用的技术包括CRISPR-Cas9系统、RNA干扰等。

2. 基因敲下(Gene knockdown):通过介导RNA干扰等技术,使目标基因在转录或转录后水平上发生阻断或降低,从而减弱其功能。

3. 具有草图基因的生育/功能阻遏:这种方法是通过设计特异性的DNA或RNA 分子,来干预目标基因的表达水平或功能。

例如,反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)可以与目标基因的mRNA配对,影响其翻译过程。

4. 特定表达缺陷提取:通过基因缺陷、重编码或突变,使基因失去正常的功能。

这种方法广泛应用于模式生物,用于揭示基因功能和疾病机制。

基因分离克隆和功能鉴定

基因分离克隆和功能鉴定

基因分离克隆和功能鉴定1.DNA提取:从目标生物体的细胞中提取总DNA。

2.扩增目标基因:使用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增目标基因片段。

PCR使用引物特异性地扩增目标基因的DNA序列。

3.电泳检测:将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过电泳检测目标基因的异常片段。

4.转染:将PCR产物转染到宿主细胞中。

转染技术有多种,常用的包括热激转染、电穿孔转染等。

5.筛选与分离:将转染后的细胞放入含有抗生素的培养基中,通过抗生素的筛选,可以筛选出带有目标基因的细胞克隆。

6.扩增目标基因片段:将带有目标基因的细胞克隆进行培养,通过培养扩增目标基因片段。

功能鉴定是对克隆的目标基因进行进一步研究,了解其功能及相关生物过程的一种方法。

常用的功能鉴定方法包括以下几种:1. 基因敲除:通过CRISPR-Cas9或siRNA等技术,在细胞或生物体中敲除目标基因,观察敲除后表型的变化,从而推断目标基因的功能。

2.基因表达:将目标基因导入细胞中,并观察已知的目标基因的功能变化。

该方法通过建立过表达或亚表达的模型,来研究目标基因对生物体的影响。

3.转基因模型研究:通过将目标基因导入实验动物模型中,观察目标基因的功能变化以及对生物体的影响。

通过这种方法,可以更深入地了解目标基因在整个生物体中的功能。

4.蛋白互作分析:通过蛋白质互作实验,将目标基因转化为蛋白质,并分析其与其他蛋白质之间的相互作用关系。

这种方法可以推测目标基因的功能及其参与的信号通路。

5.基因芯片分析:运用基因芯片技术,可以同时检测上千个基因在不同条件下的表达量,用来对目标基因和其他相关基因进行比较。

基因分离克隆和功能鉴定的应用广泛,可以用于动植物育种、疾病诊断、新药开发等领域。

例如,通过克隆和鉴定植物抗性基因,可以增加作物对病虫害的抗性,提高农作物产量和品质;通过克隆和鉴定人类基因,可以预测人类遗传疾病的风险,为个体化治疗提供依据;通过克隆和鉴定药物靶标基因,可以加速新药研发过程,提高疗效和安全性。

分子生物学名词解释

分子生物学名词解释

名词解释1. 基因(gene):2. 结构基因(structural gene):3. 断裂基因(split gene):4. 外显子(exon):5. 内含子(intron):6. 多顺反子RNA(polycistronic/multicistronic RNA):7. 单顺反子RNA(monocistronic RNA):8. 核不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA, hnRNA):9. 开放阅读框(open reading frame, ORF):10. 密码子(codon):11. 反密码子(anticodon):12. 顺式作用元件(cis-acting element):13. 启动子(promoter):14. 增强子(enhancer):15. 核酶(ribozyme)16. 核内小分子RNA(small nuclear RNA, snRNA)17. 信号识别颗粒(signal recognition partic le, SRP)18. 上游启动子元件(upstream promoter element)19. 同义突变(same sense mutation)20. 错义突变(missense mutation)21. 无义突变(nonsense mutation)22. 移码突变(frame-shifting mutation)23. 转换(transition)24. 颠换(transversion)(三)简答题1. 顺式作用元件如何发挥转录调控作用?2. 比较原核细胞和真核细胞mRNA的异同。

3. 说明tRNA分子的结构特点及其与功能的关系。

4. 如何认识和利用核酶?5. 若某一基因的外显子发生一处颠换,对该基因表达产物的结构和功能有什么影响?6. 举例说明基因突变如何导致疾病。

(四)论述题1. 真核生物基因中的非编码序列有何意义?2. 比较一般的真核生物基因与其转录初级产物、转录成熟产物的异同之处。

基因克隆实验流程

基因克隆实验流程

基因克隆实验流程基因克隆技术,又称重组 DNA 技术,是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组,获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白,以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。

获取目的基因的主要方法: 1、用限制性内切酶解染色体DNA,构建基因组文库,再从基因组文库中筛选目的基因。

该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同,在结构基因中也含有内含子序列,但是也正因为这一点构成了该法最大缺点,即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。

原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子),因而也不能表达出正确的基因产物。

2、分离纯化细胞中的mRNA,以mRNA为模板,在反转录酶作用下生成cDNA第一链,再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库,从中筛选所需的目的基因。

此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。

因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列,具有完整的阅读框架,可在原核细胞中正确表达。

3、人工体外合成基因:由于当前人工体外合成DNA的长度有限,此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。

在基因较大情况下,常需先合成多个DNA片段,然后拼接成完整的基因,此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。

4、PCR法扩增基因:PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展,为目的基因的寻找提供了有力技术工具。

用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段,或用反向PCR技术,先将特定mRNA反转录为cDNA第一链,然后再进行扩增。

用PCR法筛选基因,需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。

二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助,很难进入受体细胞,即使能进入,往往也不能进行复制和表达,因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。

为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆,必须将它们与适当的载体连接。

基因克隆操作方法有哪些

基因克隆操作方法有哪些

基因克隆操作方法有哪些基因克隆是指通过在体外复制和重组基因来制造大量基因拷贝的过程。

这项技术在生物学研究、基因治疗和工业生产等领域中得到广泛应用。

基因克隆的操作方法包括以下几个步骤:1. DNA提取:首先,需要从选择的目标生物中提取DNA。

这可以通过多种方法来完成,如细菌培养物、真核细胞提取、血液样本或组织样本等。

2. DNA切割:将目标DNA切割成特定的片段。

这一步骤可以利用限制酶来完成。

限制酶是一类能够特异性地识别和切割DNA的酶。

通过使用不同的限制酶对DNA进行切割,可以得到需要的DNA片段。

3. DNA连接:将需要的DNA片段连接到克隆载体上。

克隆载体是一种能够自身繁殖并携带外源DNA片段的分子。

常用的克隆载体包括质粒和噬菌体基因组。

连接的方法一般是通过酶切和连接酶的作用。

4. 转化:将连接好的克隆载体转化到适当的宿主细胞中。

宿主细胞常用的有大肠杆菌和酵母等。

转化可以使用电穿孔法、热激法或化学法等。

5. 选择:通过筛选和鉴定来确定含有目标基因的克隆。

常用的选择方法包括抗生素筛选、荧光筛选和基于酶活性的筛选等。

6. 扩增:将含有目标基因的克隆进行扩增。

这可以通过培养克隆细胞来实现。

7. 验证:对扩增得到的基因克隆进行验证。

验证的方法包括聚合酶链反应(PCR)、限制酶切割和测序等。

这些方法可以确定克隆中是否存在目标基因,并验证其序列的准确性。

8. 表达:将验证通过的基因克隆进行表达。

表达可以通过转录和转译来实现,使目标基因在宿主细胞中产生所需要的蛋白质。

总结起来,基因克隆的操作方法包括DNA提取、DNA切割、DNA连接、转化、选择、扩增、验证和表达等步骤。

这些步骤是基于现代分子生物学和基因工程技术的基础上发展起来的,为我们深入研究基因功能和开发新的基因工程应用提供了有力的工具和手段。

基因工程中的基因敲除技术

基因工程中的基因敲除技术

基因工程中的基因敲除技术基因工程是一项重要的科技领域,近年来,人类在这个领域取得了突破性的进展。

其中,基因敲除技术就是一项备受关注的技术。

本文将会讨论基因敲除技术的原理、应用以及可能的风险。

一、基因敲除技术的原理基因敲除技术是指通过人造手段,使得细胞或个体失去某一个或多个基因的表达,进而研究基因组的功能与机制的技术。

在分子生物学中,利用基因敲除技术可以使细胞或个体失去特定基因的表达,进而研究该基因在个体发育、疾病等方面的作用。

基因敲除技术主要分为两大类:基因靶向敲除和基因随机敲除。

基因靶向敲除指通过构建具有特异性的DNA 序列,指向并破坏某一目标基因。

基因随机敲除指借助转座子等随机介入的方式,对基因组内的大量基因进行随机敲除,并筛选出有生长或发育缺陷的个体,进而研究基因的功能。

二、基因敲除技术的应用基因敲除技术在生物学研究中具有广泛的应用,其中包括以下几个方面。

1.基因功能研究通过敲除基因的方式,可以研究到该基因在个体生存、发育、疾病等方面的作用。

在生物学研究中,人可以敲除一个基因,或同时敲除多个基因,以验证研究假设。

这对生物学研究者来说,是个非常重要的方法。

2.基因治疗基因敲除技术也可以帮助治疗某些疾病,例如有些遗传性疾病可能通过敲除细胞里致病的基因来实现治疗。

实际上,基因敲除技术是一种针对基因疾病的精准治疗方法,也为这一领域的研究提供了强有力的工具。

3.种质创制基因敲除技术还可以用于作物的种质创制,例如苹果中的酯化酶基因 (MdFAD2-2) 的靶向敲除,可以使得苹果中的油脂酸度降低,从而使得苹果更加柔软、口感更好。

在这一领域里,基因敲除技术展现出了强大的生物学价值。

4.基因敲除技术在微生物工程中的应用微生物发酵技术在农业、食品生产、生物医药等领域发挥着重要作用,而基因敲除技术在微生物工程中应用也非常广泛。

通过基因敲除技术,科学家们可以控制微生物的生长和代谢特性,从而生产出有益的化合物,例如抗生素、发酵酒精、发酵牛奶等物质。

基因敲除的方法

基因敲除的方法

基因敲除的方法
基因敲除是一种实验手段,通过干扰或删除某个基因来研究其对生物体的功能和表达的影响。

以下是常见的基因敲除方法:
1. RNA干扰(RNAi):通过引入特定的双链RNA分子,可以在细胞中诱导RNA干扰复合物(RISC),使其与特定的mRNA序列结合并导致其降解或抑制翻译。

这种方法可以通过合成小分子RNA片段作为外源性RNAi分子,或者通过转染质粒表达RNAi分子来实现基因敲除。

2. 质粒介导的基因敲除:通过构建质粒载体,将基因的反义序列整合到质粒中,并将其导入到目标细胞中。

质粒中的反义序列可以与目标基因的mRNA互补配对,形成双链结构,从而抑制基因的翻译或引起mRNA降解。

3. CRISPR/Cas9系统:CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9
(CRISPR-associated protein 9)系统是一种常用的基因敲除技术。

它利用Cas9酶与特定的单链RNA(sgRNA)结合,形成复合物,该复合物可以与目标基因的DNA序列互补配对,并导致DNA双链断裂。

当细胞修复这些断裂时,可能会引入错误的碱基,导致基因的敲除或功能丧失。

4. 胚胎干细胞敲除:通过基因敲除技术,可以在胚胎干细胞中敲除特定的基因,从而生成敲除该基因的小鼠模型。

这种方法可以用于研究特定基因的功能和生理学过程。

这些基因敲除方法可以在体外或体内进行,并根据具体研究需求
选择最适合的方法。

预防09分子生物学习题集

预防09分子生物学习题集

预防09分子生物学习题集第十九章分子生物学常用技术一、单选题1. “Sourthern Blotting”指的是(A) 将DNA转移到膜上,用DNA做探针杂交 (B) 将RNA转移到膜上,用DNA做探针杂交(C) 将DNA转移到膜上,用蛋白质做探针杂交 (D) 将RNA转移到膜上,用RNA做探针杂交(E) 将DNA转移到膜上,用RNA做探针杂交2. 分子杂交试验不能用于(A) 单链DNA分子之间的杂交 (B) 单链DNA与RNA分子之间的杂交(C) 抗原与抗体分子之间的结合 (D) 双链DNA与RNA分子之间的杂交(E) RNA与RNA之间的杂交3. 探针是通过什么标记的核酸分子(A) 用放射性同位素标记 (B) 用生物素标记 (C) 用地高辛标记 (D) A、B、C都对 (E) 用抗体标记4. 下列哪一条在分子印渍技术中不适用(A) DNA向NC膜转移 (B) 蛋白质向PVDF膜转移 (C) DNA向尼龙膜转移(D) RNA向NC膜转移 (E) 蛋白质向一号滤纸转移5. 用于核酸杂交的探针至少应符合下列哪条(A) 务必是双链DNA (B) 务必是双链RNA(C) 务必是单链DNA (D) 务必是 100bp以上的大分子DNA(E) 务必是蛋白质6. 核酸斑点杂交试验中可省略的步骤是(A) 电泳 (B) 核酸样品固定于NC膜 (C) 杂交信号检测 (D) 标记探针 E) 制备样本核酸7. 免疫印渍技术中不适合应用的步骤是(A) 聚丙烯酸胺凝胶电泳 (B) 用NC膜或者PVDF膜 (C) 靠毛细管作用进行转移 (D) 用同位素标记抗体(E) 用非同位素标记抗体8. 原位杂交是指(A) 在NC膜上进行杂交操作 (B) 在组织切片或者细胞涂片上进行杂交操作 (C) 直接将核酸点在NC膜上的杂交 (D) 在PVDF膜上进行杂交操作 (E) 在凝胶电泳中进行的杂交9. 有关DNA链末端终止法的不正确说法是A) 需要ddNMP (B) 需要ddNTP (C) dNTP:ddNTP的比例要合适 (D) 需要放射性同位素或者荧光染料 (E) 需要dNTP10. 有关DNA序列自动化测定的不正确叙述是(A) 用荧光代替了同位素标记 (B) 激光扫描分析代替人工读序 (C) 基本原理与手工测序相同 (D) 不再需要引物 (E) 需要与手工序列分析相同的模板11. 某种遗传性疾病是由一个点突变(无限制性内切酶位点变化)引起,能够(A) 用DNA单链构象多态性分析突变 (B) 用限制性片段长度多态性分析突变 C) 用Western Blotting分析突变 (D) 用电泳分析基因组DNA (E) 用电泳分析细胞中的所有蛋白质12. 免疫印渍技术指的是(A) 结合在膜上的蛋白质分子与抗体分子结合 B) 结合在膜上的DNA分子与抗体结合 (C) 结合在膜上的RNA分子与抗体结合 (D) 结合在膜上的DNA分子与RNA分子结合 (E) 结合在膜上的免疫分子与DNA的结合13. 同位素标记探针检测NC膜上的RNA分子(A) 叫做Northern Blotting (B) 叫做Southern Blotting (C) 叫做Western Blotting (D) 蛋白分子杂交 (E) 免疫印渍杂交14. 用做探针的DNA分子务必(A) 在杂交前变性 (B) 在杂交前复性 (C) 长于30个核着酸 (D) 短于30个核着酸 (E) 是双链分子二、填空题1 .只要 DNA 或者 RNA 的单链分子之间存在着一定程度的__________ ,就能够在不一致的分子间形成__________ 。

基因敲除技术路线

基因敲除技术路线

基因敲除技术路线基因敲除技术是一种常用的基因组编辑方法,通过破坏特定基因的功能,以研究该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用。

本文将介绍基因敲除技术的基本原理、常用的敲除方法和技术路线。

一、基因敲除技术的原理基因敲除是指通过人为手段使特定基因在生物体中失去功能。

在细胞层面上,基因敲除可以通过两种方式实现:直接破坏基因编码区域或间接影响基因表达。

直接破坏基因编码区域的方法包括插入缺失、替换和故障等,而间接影响基因表达的方法则通过RNA干扰或基因废弃等方式实现。

二、常用的基因敲除方法1. 全基因敲除方法:全基因敲除是将整个基因组中的某个特定基因进行敲除,即完全破坏该基因的编码区域。

常用的全基因敲除方法包括基因敲除小鼠模型、转基因植物敲除和CRISPR-Cas9等。

2. 特定基因敲除方法:特定基因敲除是指对某个特定基因进行有针对性的敲除,保留其他基因的功能不受影响。

常用的特定基因敲除方法包括siRNA靶向敲除、基因编辑酶的使用和肌肉纤维母细胞的敲除等。

三、基因敲除技术路线基因敲除技术的路线可以分为以下几个步骤:1. 确定目标基因:首先需要确定要敲除的目标基因。

通过文献研究和生物信息学分析,可以确定该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用,以及敲除后可能引起的变化。

2. 设计敲除载体:根据目标基因的序列信息,设计敲除载体。

敲除载体通常包括靶向序列、选择性标记基因和背景基因等。

靶向序列用于特异性识别目标基因,选择性标记基因用于筛选敲除细胞,背景基因用于确认敲除效果。

3. 转染敲除载体:将设计好的敲除载体导入到目标细胞中。

常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒载体介导法等。

转染后,目标细胞中将存在敲除载体和非敲除细胞。

4. 筛选敲除细胞:通过添加相应的筛选剂或选择标记基因,筛选出成功敲除目标基因的细胞。

敲除细胞可以通过PCR、Western blot 或克隆等方法进行鉴定。

5. 验证敲除效果:通过对敲除细胞进行功能性实验,验证敲除效果。

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RNAi在生物抵御病
毒感染、维持基因组中
转座子的稳定以及某些
生物生殖细胞的发育过
程中都起着重要作用。编辑课件
15
(细胞膜) (细胞核) (细胞质)



转录

(转运RNA)
达 翻译
(核糖体RNA)
编辑课件
16
RNAi现象的发现
1995年,康奈尔大学的研究人员Guo和 Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1基因 的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par-1基因的表达,但是奇怪 的是,注入正义链RNA作为对照,也同样阻 断了该基因的表达。
Cell. 1995;81(4):611-20. Section of Genetics and Development,
Sourthern blot-DNA
Nothern blot-RNA
编辑课件
6
进入多重防护的SPF动物室
检查受精母鼠
取胚
胚显微注射
编辑课件
7
DNA显微注射
显微注射完成
胚植入输卵管
养殖小鼠
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8
动物饲养
编辑课件
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(二)基因剔除技术的应用 ★ 阐明特定基因功能、基因间相互作用 ★ 阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演 进和归转中的作用,即疾病分子调控机制 ★ 在精确的时间、组织打开或关闭特定基因 ★ 可对基因进行单个碱基或大片段的修饰 ★ 确定药物作用的分编辑子课件靶点,有效筛选新药10
Gene of Interest
Gain of Function
Loss of Function
编辑课件
2
六、基因剔除技术
(一)基因剔除技术的概念
基因剔除(gene knock out)或基因靶 向(gene targeting)灭活是将生物体中某一 特定的基因功能给破坏,再研究当生物体缺少 这个基因在生长发育的过成中会有怎样的改变, 或是会好发怎样的疾病。
Demonstration of a casual role of a
gene in the initiation,maintenance, or
modulation of a phenotype by selective
decrease (knockdown) or lack
编辑课件
1
(knockout) of gene function.
+/+
转基因鼠
骨硬化
-/-
基因剔除鼠
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骨质疏松症
13
Procedure of Knockout Mice
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14
七、RNA干扰技术
(一)RNA干扰技术的概念
生 物 体 内 , 双 链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA),能识别含有其互补序列的 mRNA 并 与 之 结 合 , 在 酶 的 作 用 下 降 解 mRNA,从而干扰相应基因表达。这一现象 称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。
4288 5885 18424 13601 100000 ~3 0 0 0 0
Average gene le n g th 1K b 1K b 2K b 5.3K b 30K b
30-70K b
Байду номын сангаас
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11
Major Events in the Development of Gene Targeting
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3
原理:利用细胞复制分裂时,染色体进行 联合互换发生同源重组homologous recombination)
Prdx1 gene
编辑课件
4
ES cell
胚胎
杂合子 Prdx+/-
编辑课件
纯合子 Prdx-/-
5
Generation of Prdx1-/- mice
Prdx1+/+: wide type mice(N=34) Prdx1+/-:Prdx1 heteroxygous mice(N=88) Prdx1-/-:Prdx1 knock out mice(N=64)
Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for
establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a
putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed.
E v en ts
Year
Isolation and culture of ES cells 1981
1981
Genes
R esearchers
Evans M J and K aufm an M H M artin G R
G eneration of chim eras
1984
B radley et al.
Tools for Functional Analysis
Loss-of-Function Phenotypes
Genes
mRNAs
Proteins
• Knockouts
• Antisense • Ribozymes • siRNAs
• Dominant Negative(显型负 突变 )
• Antibodies • Aptamers(寡核苷酸适配子)
Model Organisms Used in Functional Genomics
O rganism s
E .coli Yeast C . elegant F ruit fly M ouse Hum an
G enom e size(M b)
4 .6 12 97 130 3000 3000
G ene num ber
G erm line transm ission
1986 retroviru se R obertson et al.
1986
neo
G ossler et al.
M anipulation of a specific gene 1987
H PRT H ooper et al.
1987
K uehn et al.
G ene targeting by H om ologous 1987
recom bination 1987
HPRT HPRT
D oetschm ann et al. Thomas and Capecchi
1989
c-abl
编辑课件
Schw artzberg et al.
12
骨保护蛋白 (Osteoprotegerin, OPG)
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