NGR多肽修饰的脂质体及其抗肿瘤研究进展

NGR多肽修饰的脂质体及其抗肿瘤研究进展作者：王咏，陈军，林爱华，方芸来源：《中国中药杂志》2013年第13期[摘要] NGR多肽是一种能与肿瘤新生血管内皮细胞上的CD13受体结合的靶向肽。

将NGR多肽与脂质体相连接，得到NGR多肽修饰的脂质体。

通过静脉注射该脂质体，NGR多肽能与肿瘤新生血管上的CD13受体结合，将脂质体定位于肿瘤组织，使得脂质体中的药物浓集于肿瘤部位，从而提高抗肿瘤效果。

该文从NGR多肽入手，对NGR多肽的定义、NGR多肽修饰的脂质体、NGR多肽修饰的脂质体抗肿瘤的优势和不足、NGR多肽修饰的脂质体的最新研究方向等进行了综述，并对NGR多肽修饰的脂质体未来的研究进行了展望。

[关键词] NGR多肽；NGR多肽修饰的脂质体；CD13受体；抗肿瘤脂质体是一种结构和组成类似于生物膜的超微型药物载体。

由于脂质体具有生物相容性、细胞亲和性、靶向性等性质，使其在抗肿瘤方面具有广泛的应用。

脂质体可以通过增强滞留效应（enhanced permeation and retention effect，EPR）被动进入肿瘤组织，相比于单纯的放化疗，具有一定的临床治疗优势[1-2]。

但由于血流速度较快，脂质体通过静注进入体内后并不能长时间停留在肿瘤部位，而在脂质体表面连接多肽制备成的靶向脂质体静脉注射后能立即到达靶部位，能较长时间停留在肿瘤部位，药物从脂质体中释放出来，能提高肿瘤治疗效果。

因此，抗肿瘤主动靶向脂质体已经成为研究热点之一。

主动靶向脂质体包括免疫脂质体、受体介导脂质体、糖基修饰脂质体等。

本文从NGR多肽入手，对NGR多肽的定义、NGR多肽修饰的脂质体、NGR多肽修饰的脂质体的抗肿瘤优势和不足、NGR多肽修饰的脂质体的最新研究方向4个方面对NGR修饰脂质体进行综述。

1 NGR血管靶向肽1.1 NGR多肽以及表达氨肽酶（CD13）NGR多肽即含天门冬酰胺酸-精氨酸-甘氨酸（asparagine-glycine-arginine）序列的多肽，1998年，Arap等[3]用噬菌体展示技术筛选到具有肿瘤新生血管靶向性的天门冬酰胺酰精氨酰甘氨酸短肽，它能特异性地与CD13的细胞结合。

CD13是一种跨膜金属蛋白酶，具有多种功能，如调节机体自身免疫力和细胞因子的表达，降解基质膜，激活某些信号转换通路，细胞迁移和血管生成等[4-7]。

CD13是血管生成的重要调节因子，正常血管内皮细胞上的CD13未被激活，而在肿瘤新生血管的内皮细胞上，CD13高度表达[4，8-9，12-15]。

研究发现，NGR不仅能够靶向于肿瘤新生血管内皮细胞，还能够靶向于病理或者生理状态（如炎症和视网膜疾病）下活化的血管内皮细胞[10-11]。

1.2 NGR多肽的种类及比较NGR多肽的种类有很多，一般分为直链状和环状2种。

直链状的NGR多肽有CYGGRGNG，CNGRCVSGCAGRC，GNGRGGVRSSSRTPSDKYC等。

环状的NGR多肽有KNGRE，GGCNGRC，CNGRC等。

环状NGR多肽的成环方式有2种，一种是首尾通过酰胺键成环，另一种是如果分子中有2个巯基，则可通过巯基之间形成二硫键成环。

与直链多肽相比较，环状多肽肿瘤靶向性更高。

文献研究表明，尽管直链NGR多肽与药物相连接已经显示了抑制肿瘤的活性，但是环状NGR与药物相连后抗肿瘤活性比线状高10倍[12]。

研究报道，环状KNGRE类似物与CD13的粘连能力比其链状的要高4倍[16]。

1.3 NGR多肽修饰的生物大分子NGR多肽可以与肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）、病毒等相连接，靶向性地将药物带入肿瘤血管中，抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤生长，从而达到抗肿瘤的目的。

文献报道，将NGR多肽与肿瘤坏死因子相连接，可以将药物带入肿瘤血管，NGR-TNF的抗肿瘤效果比单独使用TNF强30倍[14，17]。

Pastorino等[18]将NGR连接到包载有多柔比星的脂质体上，并将该脂质体注射入以常位神经细胞瘤细胞为模型的免疫缺陷性小鼠体内，结果发现与普通脂质体相比，NGR多肽修饰的脂质体在肿瘤部位的积聚提高了10倍。

Curnis等[19]在IFN不敏感的鼠肿瘤模型中，将多肽GCNGRC和IFNγ结合在一起，结果发现在GCNGRC的配合下，微量的IFNγ可以延缓肿瘤生长，剂量仅为临床常用量的1/500，而这种模型对单独使用IFNγ无效。

NGR多肽同时可以用于病毒的载体修饰，Grifman等[20]研究发现，带有线性和环状NGR 多肽的腺相关病毒能靶向地感染表达CD13的细胞。

将NGR多肽插入腺病毒纤维蛋白或者壳粒蛋白中可有效输送血管他丁到内皮细胞并抑制增殖、诱导凋亡[21]。

2 NGR多肽修饰的脂质体2.1 NGR多肽修饰的脂质体的制备多肽修饰脂质体的制备方法一般有2种：一种是将活化的DSPE-PEG-MAL（PEG修饰剂，常用的还有DSPE-PEG-NHS，DSPE-PEG-BTC）与成膜材料混合制备脂质体，然后加入导向化合物与活化的MAL反应，使之偶联在脂质体表面[16]，另一种是先将多肽与活化的DSPE-PEG-MAL偶联，然后将偶联产物与脂质体混合搅拌，靠DSPE端的疏水性相互作用使导向化合物连接到脂质体表面[23]。

Fabio[27]用HSPC-CHOL-DSPE-PEG2000-DSPE-PEG2000-MAL 2∶1∶0.08∶0.02摩尔比的磷脂材料，混合溶于有机溶剂中，用氮气吹干成膜，用25 mmol的HEPES和140 mmol的NaCl缓冲液水合（pH 7.4），制备得到空白脂质体。

用0.2～0.8 μm的聚碳酸酯膜挤出。

再将NGR多肽与制备得到的脂质体等摩尔混合，在4 ℃放置16 h，得到NGR靶向脂质体。

Chen等[29]用EPC-CHOL-DSPE-PEG-DSPE-PEG-GGCNGRC 20∶10∶1∶1摩尔比的磷脂材料溶于氯仿中，旋转蒸发成膜，加入123 mmol的pH 5.4的硫酸铵溶液，水浴超声30 min，所得到的脂质体用80 nm的聚碳酸酯膜在50 ℃挤出11次，挤出后用葡聚糖凝胶柱纯化脂质体。

有文献报道[22]用第2种方法制备多肽修饰的脂质体较好。

优点是防止制备脂质体时超声对多肽活性和活化的DSPE-PEG-MAL的破坏，提高了DSPE-PEG-MAL的利用率，保护了多肽的生物活性。

2.2 NGR多肽与DSPE-PEG2000的连接NGR多肽修饰脂质体的制备是先将NGR多肽与制备脂质体所需的隐形材料DSPE-PEG连接，制备得到DSPE-PEG2000-NGR，再将其与磷脂材料按一定的比例混合，最终制备得到NGR 靶向脂质体。

因此，NGR多肽与DSPE-PEG2000连接的数量直接影响到脂质体表面的NGR的密度，影响到脂质体的肿瘤靶向性。

研究表明，多肽与DSPE-PEG的连接是通过DSPE-PEG 端活泼酯与多肽的α-氨基之间反应进行的[24]。

常见的活泼酯类有-MAL，-NHS，-BTC等。

DSPE-PEG-MAL与某种NGR多肽的化学反应式见图1。

2.3 NGR多肽与DSPE-PEG2000耦联率的测定由于NGR多肽与DSPE-PEG2000的连接数量影响到脂质体靶向的效率。

因此，有必要测定NGR与DSPE-PEG2000的耦联率。

NGR多肽与DSPE-PEG2000耦联率的测定可以通过仪器分析方法来测定。

例如可以用透析法根据分子量的差异来分离偶联与未耦联的脂质体，再利用质谱、高效液相、核磁共振等来测定。

Takara等[25]在试验中用DSPE-PEG-MAL与GNGRGGYC 反应制备DSPE-PEG-GNGRGGYC，其耦联率是通过MALDI-TOF-MS检测DSPE-PEG-GNGRGGYC的相对分子量来测定。

Michael等[26]在试验中用DSPE-PEG-MAL与GNGRGC以1∶1摩尔比的量在4 ℃反应20 h制备DSPE-PEG-GNGRGC，耦联率用UPLC-ELSD（蒸发光散射检测器）来测定。

Fabio等[26]用DSPE-PEG-MAL与GNGRGGVRSSSRTPSDKYC反应制备DSPE-PEG-GNGRGGVRSSSRTPSDKYC，用CBQCA protein quantification kit来测定耦联率。

CBQCA是一种用于氨基酸，多肽及蛋白质检测的荧光衍生试剂。

CBQCA本身无荧光，但是在弱碱性的条件下，与氨基酸、多肽或者蛋白质的伯氨基反应后，生成稳定的强荧光异吲哚衍生物，再用HPLC测定氨基酸，多肽以及蛋白的含量。

2.4 多肽靶向脂质体的表面配体修饰密度研究多肽修饰的靶向脂质体，其靶向配体分子在脂质体表面修饰的密度对脂质体本身的特性及其体内靶向效果有很大影响。

周正源等[27]采用孵育插入法将带有多肽的脂质分子插入脂质体表面，用分子筛色谱分离修饰后的脂质体和未插入的多肽脂质，再用HPLC-ELSD定量分析各种成分，得到多肽靶向脂质体的靶向肽密度。

然后将修饰有不同密度靶向多肽的荧光脂质体经荷瘤小鼠尾静脉注射，分别在给药前后各时间点对小鼠扫描，计算AUC，T1/2，MRT。

结果表明，随着脂质体表面多肽的密度增加，当多肽密度大于1.298%时，小鼠肿瘤部位的AUC，T1/2，MRT都比未修饰的脂质体有所提高。

说明其在肿瘤组织中的聚集量增多，停留时间延长，肿瘤细胞的特异性机制更加明显。

2.5 NGR多肽修饰的脂质体抑制肿瘤生长的机制NGR多肽修饰的脂质体是通过与肿瘤新生血管内皮细胞间的受体-配体结合作用来抗肿瘤的。

其抗肿瘤机制可以概括为2方面的内容。

一，由于肿瘤组织的生长依赖于新生血管的生成，新生血管不仅可以提供肿瘤生长所需的营养和氧气，排泄代谢产物，而且是肿瘤转移的重要途径，将NGR多肽修饰的脂质体通过静注进入体内后，能迅速到达肿瘤部位，通过与新生血管内皮细胞上的CD13相结合，能停留于肿瘤新生血管上，抑制了肿瘤新生血管的生长和转移，间接达到抗肿瘤效果；二，由于NGR多肽修饰的脂质体能够停留在肿瘤部位，药物能够缓慢从脂质体中释放出来，降低药物在血管中循环的时间，提高肿瘤部位药物的聚集，从而提高药物抗肿瘤的疗效。

3 NGR多肽修饰的脂质体的靶向性评价方法3.1 体内活体成像——CT在体成像CT成像技术是利用X-射线对人体或者动物某部位一定厚度的层面进行扫描，取得信息，经计算机处理而获得的断面解剖图像。

利用CT成像技术可以直观观察脂质体在肿瘤部位的分布以及定量分析肿瘤组织中脂质体的含量。

Michael等[26]将H520肺癌细胞置于RPMI1640培养液中培养，然后接种于小鼠体内，当肿瘤在小鼠体内长至50 mm3时，于小鼠尾静脉注射包载碘海醇的NGR靶向脂质体，给药后用2%异氟醚使小鼠吸入麻醉并解剖，进行CT扫描，观察注射前和注射后8，24，48，72，96，144 h的图像，图像控制在15.7 cm×10.2 cm下观察。