结核分枝杆菌、厌氧菌及其它微生物的检测
CNAS-GL41临床微生物检验程序验证指南
包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在的临床微生物的检验方法（检验程序）如何验证？很多人对此非常困惑。
由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。
虽然是针对认可实验室制定的指南文件，其他实验室亦可参考。
部分容节选4.3 显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。
实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。
检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。
所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。
4.3.1 验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室人员比对（当多名人员从事该项目时）。
如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。
若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室部比对。
4.3.2比对方案4.3.2.1 样品数量每项检查应使用至少 5 份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。
实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。
4.3.2.2 检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。
4.3.2.3 结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。
4.3.3 可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80% 。
4.4.1 血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。
目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。
临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
微生物检测－微生物的检测方法有哪些
微生物检测－微生物的检测方法有哪些微生物检测是医学理论研究、生产实践中的常见工作内容。
那么，医学微生物的检测方法都有哪些呢？微生物的检测作用是什么？1.诊断临床感染性疾病。
微生物的检测可以检测各种感染性病原微生物，监控病原微生物动态信息，助力临床感染性疾病的诊断。
2.监控药品质量。
微生物检测可以发现药品中微生物限度、生物负载、细菌内毒素是否超标，确保药品质量。
3.监控医院环境质量。
微生物检测可以发现医院水、空气环境中有害微生物浓度、成分，为医院环境管理提供依据。
微生物的检测方法有哪些？（一）快速检测法快速检测法是医学微生物检测常用方法，主要是借助不同形式微生物检测仪器设备，进行快速检测，包括抗干扰培养基和微生物数量快速检测仪器瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等以及BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统等。
（二）微生物计数法微生物计数法是传统微生物检测手段之一，根据计数载体、对象的差异，可以划分为血球计数板法、比例计数法、染色计数法、液体稀释法、平板菌落计数法等。
1.血球计数板法。
血球计数板法主要是在划分网格结构稀释血液后，利用专门的血细胞计数板在显微镜下进行直接计数，是以往较为常用的技术方法，具有直观、快捷、简便、仪器损耗小的优良特点，但也存在无法区分死菌、活菌，计数结果高于实际含菌数量的缺点。
因此，血球计数板法仅适用于单细胞状态病原微生物所产生孢子计数。
2.比例计数法。
比例计数法是在液体颗粒浓度已知情况下，将其与待测细胞浓度菌液成比例混合后借助显微镜观察计数的方法。
比例计数法可以避免个人因素引起的考评误差，适用于痰液、粪便、血液、体液等存在多种细菌时需要将其中一种细菌分离的情况，但因所测得结果为死菌体、活菌体的综合，不适用于运动性较强的活菌计数。
3.染色计数法。
病原微生物体形体积微小，大多无色半透明状。
染色计数法是借助不同染料对菌体进行染色后在显微镜下进行活菌计数的方法。
根据计数对象的差异，可以选择的染色剂也具有一定差异。
常见微生物检验项目与临床意义
微生物检验项目与临床意义卫生部规定接受抗菌药物治疗的住院患者微生物检验样本送检率不低于30%（卫办医政发〔2011〕56号）。
特介绍微生物检验项目，方便统计与分析点评。
细菌检验为感染性疾病诊断和治疗提供依据：目标性治疗：提高微生物的送检率与检出率，有利于诊断与使用抗菌药。
经验治疗：根据本地区病原菌类型时间、区域、耐药谱等使用抗菌药。
调整治疗方案针对性用药：获得准确病原菌和细菌药敏结果。
细菌培养的临床意义细菌培养与其它检验项目不同，由于其样本采集易受杂菌的干扰和培养条件的限制，因而造成检测结果有时与临床不完全一致，故在分析细菌培养报告时应明白：细菌培养阴性不代表无细菌感染、细菌培养阳性不代表该菌一定是病原菌，应结合患者具体情况而定。
1、血液和骨髓培养目前血液培养仍然是菌血症和败血症的细菌学检验的基本方法，并且广泛地应用于伤寒、副伤寒及其它细菌引起的败血症的诊断。
菌血症系病原菌一时性或间断地由局部进入血流，但并不在血中繁殖，无明显血液感染临床征象。
常可发生在病灶感染或牙齿感染，尤以拔牙、扁桃体切除及脊髓炎手术后等多见。
败血症是指病原菌侵入血流，并在其中大量生长繁殖，造成身体的严重损害，引起显著的全身症状（如不规则高热与全身中毒等症状），它多继发于组织器官感染，尤其是当机体免疫功能低下、广谱抗生素和激素的应用及烧伤等。
单次的血培养结果，对临床无鉴别指导意义，应多次多部位采集血液进行培养，才可判定检出菌究竟是病原菌还是污染菌。
抽血时应特别注意皮肤消毒和培养瓶口的灭菌。
2、脑脊液培养正常人的脑脊液是无菌的，故在脑脊液中检出细菌（排除操作中的污染）应视为病原菌。
引起脑膜炎的细菌种类不同，化脓性脑膜炎病原菌多为脑膜炎奈瑟菌，除此之外尚有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等。
3、尿液培养尿液细菌培养对于膀胱和肾脏感染的及早发现和病原学诊断很有价值，对于尿道、前列腺以及内外生殖器的炎症也有一定价值。
临床感染之病原体检验
(二)细菌学检验程序
1. 细菌学检验见第一节血液感染及有关章节。 2. 病原体检测只对某些疾病诊断具有意义。
由于菌群复杂，正常寄生菌和种类繁多， 一份咽拭子分离出来的细菌不一定与疾病 有关，另外由于接受药物治疗，使某些细 菌受到抑制，可影响阳性检出率。因此， 在分析结果时应紧密结合临床。
3. 鼻咽拭子标本的检测有助于猩红热、风湿热、急性肾小球肾 炎病人的临床诊断；还可检出化脓链球菌、奋森螺旋体、脑 膜炎奈瑟菌、麻风杆菌等以协助诊断；对白喉、百日咳或口 腔念珠菌感染的诊断有意义，应结合临床。
第四节 上呼吸道感染
(一)常见病原体 1.革兰阳性
金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、化脓 链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、白喉棒 状杆菌、厌氧菌、炭疽芽胞杆菌、白假丝酵母 菌、放线菌、奋森螺旋体; 2.革兰阴性 脑膜炎奈瑟菌、大肠埃希菌、肺炎克雷白杆菌、
铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肠杆菌、不动 杆菌、百日咳杆菌、军团菌、肺炎支原体
4. 呼吸道还可见病毒感染，常见 普通感冒或流行性感冒，咽炎 和扁桃腺炎等，均应结合临床 进行诊断。
第五节 下呼吸道感染
1.革兰阳性
(一)常见病原体
金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、
肺炎链球菌、A群链球菌、肠球菌、结核
分枝杆菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽胞杆
菌、白假丝酵母菌、毛霉、曲霉;
2.革兰阴性 脑膜炎奈瑟菌、黄色球菌、大肠
3.抗体检测
为病毒检测的快速诊断方法，较常用。 (1)中和试验：主要检测中和抗体lgG，此抗
体持续时间长有诊断意义，阳性率和特异 性均高。双份血清效价4倍增高。 (2)特异性IgM抗体测定：此抗体在病后4天即 可出现，2周可达高峰，常用于早期诊断。 用 ELISA、间接免疫荧光法等检测，敏感 性和特异性较高。
《医学微生物学》三大常规的微生物学检查
《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。
因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。
1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。
病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。
对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。
2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。
若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。
3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。
另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。
4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。
如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。
【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。
当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。
细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。
一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。
穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。
2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。
伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。
3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。
谈一谈质谱技术在临床微生物检测中的应用
谈一谈质谱技术在临床微生物检测中的应用随着医疗技术水平的不断进步，临床检验中引入了越来越多的高新技术，质谱技术就是其中之一，其主要是一种对蛋白质进行分析的较为强大的工具，其存在高通量、快速准确、自动化、操作简便等优点，所以在临床的微生物检验中应用较为广泛，在鉴定病原体方面具有显著效果。
这一技术从出现到发展对传统检验模式进行了挑战，令检验的实效性和灵敏度得以提升。
因此，为帮助病人们进行了解，下面就来介绍一下质谱技术在临床微生物检测中的主要应用。
一、质谱技术的原理和优点质谱技术的主要工作原理是把基质和样品进行混合，而后将其点在相应的金属靶盘上，构成一个共结晶，而后将激光当做能量的来源对结晶体进行辐射，此时基质分子会对能量进行吸收，令样品开始吸附，而后发生电离反应，形成质荷比不同的带电离子。
而样品离子处于加速的电场下，可以产生相同的动能，而后经过高压的加速和聚焦，进入到飞行时间的质谱分析器中，完成质量分析的操作。
其中，飞行时间的平方和离子质荷比呈现正相关的关系，通过计算机的处理，可以形成质量图谱，经过相关的软件进行分析和比较，可以筛选以及确定特异性的图谱，进而鉴定或者区分菌株以及微生物。
现今的临床微生物实验中，在鉴定细菌方面大都依靠传统生化反应以及形态学技术等，在鉴定细菌方面也需首先进分离纯化，就算利用相关的自动化鉴定仪，也需保证时效性的要求，特别是在检测菌血症这类重症感染的过程中。
而质谱技术一般不要求样品纯度，所以样品检测过程中可以不进分离和纯化，可以进行直接的点样。
该方式的操作较为简便，还可不断扩展数据库，所以可准确且快速地完成检测，还可保证高通量。
二、质谱技术在临床微生物检测中的应用就现今的情况来看，质谱技术现已被广泛应用于临床微生物检测中，主要检测的菌种包括霉菌、酵母菌、分枝杆菌、厌氧菌、需氧菌、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等。
1、鉴定及分析细菌质谱技术可对多种细菌进行充分分析，其中，检测的样本既可为进分离培养的一些纯菌落，同样也可为原始的临床样本，其可以被直接用来检测。
临床微生物学检验理论课：03常见类型标本病原体检测
导管相关性血流感染不保留导管
从独立的外周静脉无菌采集2套血培养， 无菌状态下取出导管并剪下5cm导管尖端或近心
端，进行Maki半定量平板滚动培养或者定量培养。
采血后在2h内送到检验科，立即放入血液培养仪，自动培养 并实时检测。如不能及时运送，则室温保存，不要放冰箱， 以免嗜血杆菌、奈瑟菌、链球菌冻死。
洋葱伯克霍尔德菌
6% 8%
9%
嗜麦芽寡养单胞菌 近平滑念珠菌
腐生葡萄球菌
白色念珠菌
热带念珠菌
产酸克雷伯菌
血液标本分离菌株种类及构成嗜 液水 化比气 沙单 雷%胞 菌菌
无乳链球菌
二、尿液标本病原菌检验
目的和意义
检测泌尿系统感染； 一般进行细菌和真菌培养、菌落计数和药敏； 离心后对沉渣涂片检查，革兰染色或抗酸染色； 也可用于淋球菌培养和涂片检查。
为细菌提供生长中心，提高生长 速度，提高检出率，一个BACTEC 血培养瓶的树脂作用表面积=5个 标准足球场的面积。
厌氧瓶，提高兼性厌氧菌检出率 帽子和标签纸左上方为黄色， “Standard Anaerobic/F”， 血液量3-10ml，8-10ml最佳， 不仅用于厌氧菌培养，由于营
养丰富，还可以大大提高兼性 厌氧菌的检出率； 穿刺液或中段尿等厌氧菌培养 也可用厌氧血培养瓶。
厌氧瓶提高血培养阳性率20%以上
7072份标本，同时需氧瓶和厌氧瓶血培养； 640份阳性，阳性率9%； 需氧瓶和厌氧瓶同时阳性，352份，占55%； 仅需氧瓶阳性，而厌氧瓶阴性，166份，占26%； 如仅用单瓶需氧瓶，阳性合计，518份，占81%； 仅厌氧瓶阳性，而需氧瓶阴性，122份，占19%； 所以强调每次采血“双瓶”（需氧瓶和厌氧瓶）。
为避免皮肤污染，采集时须严格消毒
2008 危重病人发热评估指南
危重病人发热评估指南：2008美国危重病协会和传染病协会在一些重症监护病房，评估一个新出现的发热引发的机体自动反应，包括很多费时、昂贵和损伤性的检验。
此外，病人还要承受身体的不适、不必要的辐射、运送到ICU以外的场所、以及因必要的检验造成一定量的失血。
而这些可能在24小时内要多次发生，之后的每天也都要发生。
在一个医院和病人资源的利用都处于强化监督之下的时代，评估多少发热病人需要进行谨慎和有价值的检查是有必要的。
美国危重病协会和传染病协会成立的一个专责小组，对ICU的新发热的成年危重病人（大于18岁）提供指南，目的是促进合理的资源利用和有效的评估。
指南认为，任何不明原因的体温升高都需要专业的医务工作者进行评定，包括在任何实验室检查和影像学检查之前回顾病人的病史，以及进行有重点的体格检查。
表1：危重医学学会的参考文献和推荐意见的分级系统参考文献A.随机，前瞻性，对照调查B.非随机，并行，历史队列调查C.同行评议，国家最新文章，回顾性文章，评论，重大个例报道D.非同行评议发表的意见，如教科书陈述和官方组织出版物推荐意见1级：科学论据上可信服的结论2级：科学论据和危重病专家强烈支持的合理结论3级：科学论据不充足但是现有数据和危重病专家观点都广泛支持的结论此指南专业地论述了如何评价一个住在ICU的成年病人新出现的发热，而他之前没有发热并且最初发热的源头不明显。
指南将作为一个出发点来帮助住院医生和会诊医生以给病人建立一个有效且有价值的合适的途径。
那些推荐意见是由强有力的证据根据危重病医学会的标准来得出的（表1）。
开始发热评估：测量机体的温度并为诊断而定义发热的阈值发热的定义。
发热的定义是任意的，取决于定义它的目的。
一些文献把发热定义为核心温度>38℃（100.4°F）。
另外一种定义则是两次连续的体温>38.3℃（101°F），对于粒细胞减少的病人，发热则指不受外界环境影响时单次口腔温度>38.3℃，或者>38.0℃并且时间超过1小时。
实验五 尿标本、厌氧菌、分枝杆菌
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㈣ 检验程序
尿标本（中段尿）
涂 片 定量培养
分离培养
淋病奈瑟菌培养
直接 离心
革抗 兰酸 染染 色色
菌落计数
BAP/ MAK/ EMB
37℃ 18～24h
可疑菌落
巧克力培养基
37℃ 24～36h 5% CO2
涂片GS 鉴定试验 药物敏感试验
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定量取样方法：
菌落计数
1. 标准定量接种环：用1μl或10μl 的标准定量接种环， 以垂直方向持拿，使环圈刚好浸入尿液表面（不可使尿 液碰到取菌环上方的环柄），取尿液进行接种。
膀胱穿刺尿 任意数目
所有细菌都有意义，需做鉴定和药敏，
注：中段尿和导尿标本有4种以上微生物生长均报告“标本污染”。
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㈤ 结果评价与报告
2. 检测结果的报告方法
阴性结果报告：培养48 h 无菌落生长或菌落数未达到即为阴性。
报告方式:“培养48 h无菌生长”或直接报告菌落数(CFU/m1) 。
可疑结果报告：
2. 微量移液器法：无定量接种环的实验室，可使用无菌的5 μl 微量 移液器吸取尿液加入平板，再用接种环划线接种，将平板菌落数乘 以200，即为每ml 尿液中所含有的细菌数（CFU/ ml）。
3. 普通接种环法：
定量接种基数法：
直接划线法、倾注平板法。
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㈤ 结果评价与报告
1. 不同方法采集的尿标本培养结果评价
（4）留置导尿管: 先消毒导尿管外部，按无菌操作
方法用注射器穿刺导尿管吸取尿液。防止混入消 毒剂，注意不能从尿液收集袋中采集尿液。
（5）小儿尿液收集包：用于无自控能力的小儿。很
难避免会阴部菌群污染产生假阳性，所以只有在 检验结果为阴性时才有意义。如果结果为阳性， 应结合临床进行分析。
临床微生物学检验
临床微生物学检验一、痰培养1．英文或缩写：Bacterial Culture of Sputum2．标本采集及注意事项：患者清晨起床，用清水反复漱口后，用力咳深部第一口浓痰置无菌容器中尽快送检。
痰量极少者可用45℃ 10％氯化钠雾化吸入导痰。
对咳嗽乏力或昏迷病人，可用吸痰管经鼻腔或口腔抵达气管腔内吸引痰液。
或用纤维支气管刷直接在病灶部位采集高浓度的感染病原菌，但不能完全避免咽喉部正常菌群污染。
双侧肺部感染伴人工气道如气管切开或气管插管者，可用吸痰管经人工气道估插至肺支气管水平吸引痰液。
对重症、难治、或伴免疫抑制、或疑似厌氧菌引起的医院内肺部感染可采用环甲膜穿刺经气管吸引(TTA)、经胸壁穿刺肺吸引(LA)、经纤维支气管镜或人工气道作防污染双套管毛刷(PSB)或防污染支气管肺泡灌洗(PBAL)采集无口咽部菌群污染的痰液，进行精确的感染病原学诊断。
小儿取痰可用弯压舌板向后压舌，用棉拭子深入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时岢喷出肺部和气管分泌物，粘在棉拭子上，取出检查。
厌氧菌培养通过气管穿刺取痰液，采集后立即排出空气，插入无菌的橡皮塞送检。
痰标本不能及时送检者，可暂存4℃冰箱。
室温下延搁数小时，定植于口咽部的非致病菌呈过度生长，而肺炎球菌、葡萄球菌和流感杆菌检出率则明显下降。
3．检测及报告时间：每天检测，3 天报告结果。
4．正常参考值：正常人只有正常菌群生长，且正常情况下不致病。
5．临床意义：大叶性肺炎、小叶性肺炎、中毒性肺炎等多为肺炎链球菌引起。
近年来，由于抗生素的大量应用，耐药性金葡菌引起的肺炎有所增加，肺炎克雷伯菌、化脓性链球菌、流感嗜血杆菌引起的肺炎则有所减少，少数肺炎也可由大肠埃希菌等革兰阴性杆菌引起。
新儿肺炎产前或产时感染者以病毒、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌最为常见，而产后感染者则以金黄色葡萄菌、链球菌、肺炎链球菌为多见。
慢性支气管炎的病因是多方面的，目前一般认为，病毒感染削弱呼吸道的防御功能，因而招致“条件致病菌”，主要是流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的继发感染。
细菌实验室检查项目
细菌室常规检测项目：一形态学检查（Morphological Examination）（一）各种染色1革兰染色（Gram stain）：将细菌分为革兰阳性菌如葡萄球菌属，链球菌属等；革兰阴性菌如大肠埃希菌沙门菌，志贺菌等。
2抗酸染色(Acid-fast stain)：通过染色将细菌分为两大类：抗酸性细菌和非抗酸性细菌，抗酸性细菌种类较少，如结核分枝杆菌，麻风分枝杆菌等。
正常：未见。
抗酸染色，找到红色分枝杆菌，及报告“找见抗酸分枝杆菌”，量可以用加号表示：++++每个视野>10根+++每个视野发现1～10根++100个视野发现10～99根+300个视野发现3～9根±300个视野发现1～2根3异染颗粒染色（Metachromatic granula stain）：用于检查棒状杆菌。
4墨汁染色（Indian ink negative staining）：用背景着色，而细菌本身不着色的染色方法，用于脑脊液中查找新生隐球菌。
正常：未见。
5鞭毛染色（Flagella stain）：鞭毛的数目和位置随细菌种类而不同，可分为周毛菌、单毛菌、双毛菌和丛毛菌，是细菌分类和鉴定的重要依据。
如霍乱弧菌是单鞭毛菌。
6荚膜染色（Capsules stain）：荚膜是细菌壁外一层粘液性多聚物，赋予致病菌的侵袭力。
染色将荚膜染成与菌体不同颜色，可作为细菌鉴定的依据。
如肺炎链球菌。
（二）涂片检测(smear)1便球杆比检查( stool cocus/bacillus)：即革兰阳性球菌与革兰阴性杆菌之比。
正常值：便球杆比：1:3临床意义：健康人肠道内寄居着大量厌氧菌和小部分需氧菌。
除人乳喂养的婴儿肠道内以革兰阳性球菌为主外，其余人均以革兰阴性杆菌占绝对优势。
在肠道发生致病菌如沙门、志贺、弧菌感染时往往由于使用抗生素而是革兰阴性杆菌受到抑制，此时球菌/杆菌比值有可能变大。
若比值显著增大，常提示肠道菌群紊乱或发生二重感染。
肺结核病患者细菌学的检验结果分析
肺结核病患者细菌学的检验结果分析肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的传染性疾病。
细菌学检验是诊断肺结核的重要手段之一，可以通过检测痰、组织或体液中的结核分枝杆菌来确认诊断。
肺结核的细菌学检验主要包括以下几种方法：1.痰液涂片：痰液是检测肺结核的最常用样本之一、将痰液制成涂片，经过染色后在显微镜下观察，可以观察到结核分枝杆菌。
特别的染色方法有酸性杆菌染色、抗酸杆菌分枝杆菌染色和氟素染色等。
2. 痰液培养：将痰液样本采用无菌技术，接种于合适的培养基上，寻找结核分枝杆菌的生长。
常用的培养基有Lowenstein-Jensen培养基、Middlebrook 7H10/7H11培养基等。
结核分枝杆菌是一种生长缓慢的细菌，通常培养时间为3-6周，有时甚至需要多次培养才能得到阳性结果。
3.阳性检测方法：结核分枝杆菌存在种类繁多，目前常用的检测方法有PCR、核酸杂交、基因酶联免疫吸附实验等。
这些方法可以从痰液、组织或体液中检测结核分枝杆菌的基因或特异性抗原，进一步确认诊断。
细菌学检验结果的分析与疾病的不同阶段和严重程度相关。
在初次感染期，结核分枝杆菌可能无法在痰液中检测到。
而在活动性肺结核病例中，一般可以从痰液中检测到结核分枝杆菌。
阳性结果表明患者存在活动性结核感染，可以进行进一步治疗和控制。
而阴性结果并不能完全排除结核感染，需要综合考虑病史、症状和其他检查结果。
除了以上的检验方法，还有许多其他的方法可以用于肺结核的诊断。
例如，胸部X射线、胸部CT扫描、结核菌素试验和干扰素-γ释放试验等，这些方法可以了解肺结核的病变程度和免疫状态。
总的来说，细菌学检验是肺结核诊断的重要手段之一、结核分枝杆菌的检测有助于确定患者的感染状态和疾病严重程度，为临床治疗提供重要的依据。
然而，细菌学检验结果应该与其他临床和实验室检查结果相结合，进行全面的评估和诊断。
呼吸道感染的微生物检验
•病原学检查： *痰或胸水涂片检查，培养致病菌及抗生素敏感试验，连做2、3次。 *免疫荧光，酶联免疫吸附试验，对流免疫电泳等方法检测血清病原菌的 抗原或抗体。 *聚合酶链反应检测病原体。
•血液检查：细菌感染者的白细胞计数及中性粒细胞一般均升高， 可有核左移。
• 不可接受的标本包括唾液样痰、24h收集的痰和拭子。临床医生应当 督导患者咳出合格的痰标本，而非唾液。
• 下呼吸道标本应在采集后立即（20min内）送至细菌室，并于1h内 接种，室温下放置超过2h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的分离率， 这是由于定植于上呼吸道的非致病菌过度生长所致。特别需要注意的 是，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌不喜低温，此类下呼吸道标 本勿冷藏。
（2）确诊某些呼吸系统疾病，如肺结核、肺癌、肺吸虫病等；（3）观察疗效和预后判断。
如何提高诊断水平
• 一、临床医生应当注意标本的正确取材。
• 采集合格标本对细菌的诊断尤为重要 • 送检指征：凡是发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，并伴有胸痛、气急、肺部闻及湿罗
音，外周血白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液，
什么是呼吸道感染
• 呼吸道感染包括鼻、咽、喉、气管、支气管及肺部的感染性炎症。呼吸道以环状 软骨为界，分为上、下呼吸道。上呼吸道包括鼻、咽、喉，其感染称上呼吸道感 染。下呼吸道包括气管、主支气管、叶、段支气管直至肺泡，其感染称下呼吸道 感染。
• 上呼吸道感染主要病原体：细菌和病毒
• 下呼吸道感染病原体包括：细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体、立克次体 等微生物及较少见的原虫、吸虫、绦虫等寄生虫。
耐甲氧西林菌株：
微生物标本采集操作规程
微生物标本采集操作规程基本原则1.发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查，三级医院微生物标本送检率不应低于60%。
2.尽量在抗菌药物使用之前采集标本。
3.标本采集时应严格无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其它杂菌污染。
4.标本采集后应立即送至细菌室。
床旁接种可提高病原菌检出率。
5.以棉拭子采集的标本如咽拭子、肛拭或伤口拭子，宜插入运送培养基送检。
6.送检标本应注明姓名、床号、标本来源、检验目的和标本采集具体时间，使细菌室能准确及时接种相应的培养基和适宜的培养环境，提高阳性检出率。
一、血液与骨髓的送检方法1.一般原则:在出现临床症状后应尽快抽血样作培养，最好在发热初期、高热或寒战时，原则上应选择在抗菌药物应用之前，对已应用药物而病情不允许停药的患者应在下一次用药前采血。
2.采血部位：肘静脉。
疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉或股动脉采血为宜，切忌在静滴抗菌药物的静脉处采取血标本。
3.采血最佳时间与频率：急性败血症应在治疗前24小时内抽血3次或者更多次，并在不同部位，如左右手臂或颈部，分别做厌氧、需氧培养以及内毒素、降钙素原检测；急性心内膜炎在治疗前1-2小时内分别在3个不同部位抽血样；怀疑伤寒病人，在病程第1-2周内采静脉血液；肺炎链球菌在寒战、高热或者休克时；布鲁杆菌感染除在发热期采血，还要多次采血，一般是24小时抽3-4次；分枝杆菌感染早期采血样阳性率高。
怀疑菌血症因尽早采血，体温上升阶段采血可提高阳性率，但要防止因等待而延误时机，对已用抗菌药物而不能停药者，可在下次用药前采血。
对疑为伤寒病人，在第1-3周内采集骨髓是最佳时间，在病灶或髂前（后）上棘处严格消毒后抽取骨髓1ml 作细菌培养。
4.采血部位的局部皮肤应严格消毒。
将采集的血液注入血培养瓶前，认真识别相应颜色的瓶，并仔细检查培养瓶有无变色或混浊。
过火消毒针头，血培养瓶撕掉塑料盖后，瓶口不是无菌部位必须消毒。
消毒不能用碘酒消毒而是75%酒精消毒。
临床微生物检验(2014)业务能力等级标准
52-临床微生物检验 (专业业务能力)（2014年修订）一、近十年来临床微生物学检验实验室诊断的方法，微生物检验技术的进展以及引进、开发、改进；临床微生物快速诊断方法及优缺点。
自动化微生物诊断方法的种类、微生物检验技术的进展情况；引进、开发和改进的诊断方法概述。
叙述临床微生物快速诊断方法及优缺点。
当今病原微生物检验学的关注热点。
二、厌氧菌、腹泻病原菌、非发酵菌的分离培养、鉴定。
厌氧菌的概念、革兰氏阳性厌氧球菌常规鉴定、韦荣氏球菌属常规鉴定、革兰氏阴性厌氧无芽胞杆菌常规鉴定、革兰氏阳性厌氧芽胞杆菌常规鉴定、兼性厌氧杆菌的分离培养鉴定及临床意义。
腹泻病原菌的初步分类、培养和鉴定。
肠杆菌科的分类、生物学特性和常规鉴定、肠杆菌科与其它科细菌的鉴别、肠杆菌科初步分群、苯丙氨酸阳性的各属及种的鉴别、葡萄糖酸盐阳性的各属及种的鉴别，苯丙氨酸、葡萄糖酸盐阴性的各属及种的鉴别、深部真菌的分离、培养及鉴定。
L型细菌的概念、菌落形态种类、培养特性、检验技术及方法评价。
革兰氏阴性杆菌的耐药机制种类及检测方法。
三、肠道杆菌的分类及检验;β－溶血性链球菌分群、肠球菌与其他触酶阴性革兰阳性球菌的鉴定。
在控制院内感染工作中临床细菌室所起的作用，结核分枝杆菌与非典型分枝杆菌的形态与培养特性。
四、血液及骨髓标本的接种和检验步骤。
脑脊液的涂片检查及培养。
脑膜炎双球菌的培养，结核分枝杆菌培养和真菌(隐球菌)培养及鉴定。
尿液的涂片检查、尿定量培养、淋病奈瑟氏菌培养。
呼吸道标本涂片检查及培养、合格呼吸道标本的指征。
粪便标本的涂片检查、培养及各种肠道致病菌的培养及鉴定。
胆汁标本的处理及培养检查。
眼、耳、鼻、喉拭子标本的处理。
脓汁标本的处理。
穿刺液标本的处理。
生殖器分泌物标本的涂片检查及培养鉴定。
细菌对抗菌药物的敏感试验方法及琼脂扩散法和稀释法的质量控制，名词解释：敏感、中介、耐药、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度。
临床细菌检验的室内质量控制和室间质量控制和评价。
实验6 厌氧菌、棒状杆菌、分枝杆菌等
蛋黄琼脂平板：Nagler反应 牛奶培养基：“汹涌发酵”
Nagler反应
产气荚膜梭菌产生 卵磷脂酶分解卵黄
中卵磷脂所致
汹涌发酵
将产气杆菌 接种于紫牛 奶培养基中
在牛奶中分解乳糖， 使其中酪蛋白凝固
细菌产生大量H2和CO2
白喉棒状杆菌生物学特性
蛋黄, 马铃薯, 甘油， 孔雀绿
麻风分枝杆菌
•形态、染色与结核分枝杆菌相似 •麻风分枝杆菌是一种典型胞内菌 (麻风细胞) •体外人工培养至今仍未成功
Albert 染色法
•制片同革兰染色 •甲液染5分钟→水洗→再以乙液（碘液）染1分钟 →水洗→印干→油镜检
抗酸染色法
抗酸染色法(acid-fast stain) ：以5％石炭酸复红
Albert染色(异染颗粒)
Elek平板试验结果
白喉杆菌菌苔 沉淀线(阳性) 含白喉抗毒素滤纸片
Elek Test
结核杆菌
形态与染色
细长略带弯曲 细胞壁脂质含量高，肽聚糖外大量分
枝菌酸 齐－尼抗酸染色阳性
培养特点
专性需氧 • 液体培养基 ： 表面生长 ( 菌膜) • 固体培养基： 粗糙型菌落 (菜花状) 生长缓慢,营养要求高,常用罗氏培养基
实验六
厌氧性细菌、棒状杆菌、分枝杆菌等
Content
示教 破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的形态、染色性及培养特性 Nagler反应、汹涌发酵 结核分枝杆菌：抗酸染色法，液体、固体培养 麻风分枝杆菌：抗酸染色 白喉棒状杆菌： Albert染色法、吕氏血清斜面、 亚碲酸盐 平板
操作 产气荚膜梭菌致病性实验 病人痰液（结核分枝杆菌）抗酸染色法 口腔螺旋体的检查 肠道致病菌粪便标本的分离与鉴定（续）——血清学反应
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最终鉴定需要进行生化反应及终末代谢产物等检 查。
生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验 硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂 酶试验、明胶液化试验、硫化氢试验等——厌氧 API条。
目前用于厌氧菌快速鉴定还有自动微生物鉴定系 统等。
实验内容
1、记录抗酸染色步骤。 2、油镜下观察抗酸杆菌涂片，并记
厌氧菌的分离与鉴定
（三）标本接种
标本接种3个血琼脂平板，分别置于有氧、 无氧和含5-10%CO2的环境中培养。若只 要求检测厌氧菌，只需接种1个厌氧血琼 脂平板。
厌氧菌的分离与鉴定
（四）耐氧试验
当厌氧血平板上有细菌生长时，为了确 定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。挑 取菌落分别转种2块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板，然后将平板分别放 置在需氧、厌氧和CO2环境中培养。
荧光染色结果报告
—：观察70个视野未发现抗酸杆菌； ±：70个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：50个视野内发现2-18条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现36条以上抗酸杆菌。
厌氧菌的分离与鉴定
厌氧菌标本的采集 涂片与染色 标本接种 耐氧试验 鉴定试验
干后油镜下观察结果。
抗酸染色结果观察
油镜下观察涂片，在淡蓝色背景下可见染成红 色细长或分枝状杆菌，此为抗酸染色阳性细菌 。
抗酸染色结果报告
—：观察300个视野未发现抗酸杆菌； ±：300个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：100个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现9条以上抗酸杆菌。
金胺“O”荧光染色法
染色步骤：
① 荧光染色：涂片固定后，滴加荧光染色金 胺“O”染色10-15min，水洗；
② 脱色：用0.5%盐酸酒精脱色3-5min，至无 黄色染液脱下为止，水洗；
③ 复染：用0.5%高锰酸钾复染2min，水洗。 待干后，用荧光显微镜高倍镜下检查。
荧光染色结果观察
高倍镜下观察涂片，在暗视野背景下抗 酸杆菌呈黄绿色或橙黄色荧光。
录结果。
试剂成份： 试剂组成
1、石碳酸复红溶液 2、酸性酒精溶液 3、亚甲基蓝溶液
主要成份 碱性品红、苯酚 乙醇、盐酸 亚甲蓝
抗酸染色
染色步骤： ① 初染：将固定好的涂片置于染色架上，滴
加数滴石炭酸复红溶液，作用10min; ② 脱色：用3%盐酸酒精脱色，直至涂片无红
色染液脱下为止，流水冲洗； ③ 复染：用亚甲蓝溶液复染1min，水洗。待
高压处理 痰液标本经121℃,30min高压消毒后离心处理
结核分枝杆菌形态观察
（2）涂片
取洁净玻片，在酒精灯上烤去油脂成分， 做好标记，用吸管吸取离心后标本沉渣， 制成20mm×15mm大小的厚膜涂片。自然 干燥后，固定，进行染色。
结核分枝杆菌形态观察
（3）染色 抗酸染色法 金胺“O”荧光染色法
结核分枝杆菌、厌氧菌及其它 微生物的检测
苏州大学附属第二医院检验科 谢小芳
实验程序
一、实验目的 二、理论内容 三、实验内容 四、实验报告
实验目的
• 掌握结核分枝杆菌形态和染色结果 报告。
• 熟悉厌氧菌培养和鉴定流程。
结核分枝杆菌形态观察
（1）标本处理
化学处理 将痰液标本加入等量的6%次氯酸钠后，消化 作用30min后离心处理；
金胺“O”荧光染色法
原理：
抗酸性菌用荧光染料Auramine O(金胺O)染色 后，用含有紫外光源的荧光显微镜检查，将 会发出闪亮的橘黄颜色，这种方法可用低倍 镜检，因此能更快速找出抗酸性菌。
金胺“O”荧光染色法
试剂成份： 试剂组成
1、金胺O染色液 2、酸性酒精溶液 3、复染液
主要成份 金胺O 盐酸、乙醇 高锰酸钾
抗酸染色
原理：
结核菌、麻风杆菌等抗酸性菌，因其菌体表 面有一层类脂或脂质之皮膜而不易着色，但 一经着色后，酸性酒精的作用亦是不容易把 它脱色。利用此特性并以增强的染色液予染 色，然后再以酸性酒精加以处理，使其脱色 后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最 初色素的颜色(红色)，也就易于鉴别。
抗酸染色
厌氧菌的分离与鉴定
厌氧菌的分离与鉴定
A区：在厌氧环境中生长，而在需氧和CO2环境 中不生长，为专性厌氧菌；
B区：在需氧、厌氧环境中均能生长，为兼性 厌氧菌；
C区：在厌氧环境中不生长，为专性需氧菌； D区：在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不
佳，而在CO2环境中生长良好，为需CO2菌。
厌氧菌的分离与鉴定
厌氧菌的分离与鉴定
（一）厌氧菌标本的采集
1、脓胸及未破溃的脓肿 2、肺分泌物和痰标本 3、尿液标本 4、血液标本 5、窦道及深部脓肿等标本
厌氧菌的分离与鉴定
（二）涂定厌氧菌提供参考和依据。 如厌氧菌芽胞在菌体极端且大于菌体呈 鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。