HPLC法同时测定禽肉中氯羟吡啶和多种磺胺类药物残留

兽药科技HPL C法同时测定禽肉中氯羟吡啶和多种磺胺类药物残留
刘伟1,李明哲1,张海仙2,卢长福1,张目华2
(1.聊城出入境检验检疫局,山东聊城252000;
2.山东凤祥集团总公司,山东阳谷252322)
摘要:建立了用于禽肉中氯羟吡啶和磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺262甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉等残留测定的高效液相色谱法。

样品以乙腈2氯仿提取,正己烷脱脂净化,以Sy m m etry C185L m(416m m@150mm)色谱柱进行分离,二极管阵列检测器检测,梯度洗脱测定氯羟吡啶和8种磺胺。

回收率在7117%~9917%,相对标准偏差为115%~318%,最低检测限除磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉为0102m g/kg外,其余都可达到0101mg/kg。

该方法已成功应用于禽类样品多兽药残留的检测。

关键词:禽肉;高效液相色谱;药物残留;氯羟吡啶;磺胺
中图分类号:S859文献标识码:A文章编号:052925130(2009)0320064203
氯羟吡啶,商品名为克球酚,化学名为3,52二氯22,62二甲基242羟基吡啶[1],是一种预防畜、兔球虫病的饲料药物添加剂。

由于过高的氯羟吡啶残留会对人类的健康带来危害,所以许多国家对氯羟吡啶的残留限量作了限定,2002年中国国家质检总局第37号公告公布的/肉禽出口企业0禁用药物名录中也包括氯羟吡啶。

磺胺类药物属于合成抗菌药物,抗菌谱广,价格低廉,性质稳定,被广泛地应用于预防和治疗食源性动物的细菌感染性疾病。

但是如果长期使用或者不按
收稿日期:2008205225;修回日期:2008212222
作者简介:刘伟(19722),男,硕士。

规定用药会导致这些药物残留在动物性食品中,给人类身体健康带来很大的危害[2]。

各国政府对磺胺类药物(sulf ona m i d es,S A s)在动物性食品中使用严格规定了最高残留限量(MRL),韩国要求动物性食品中磺胺类药物残留小于011mg/kg;欧盟(EEC)第675/92号规定了动物性食品中磺胺类的残留量不得超过011mg/kg[3]。

对这2种兽药残留的检测都分别有报道[4-8],但这些方法仅测定动物性食品中的一种兽药残留,禽类在饲养过程中可能会用到氯羟吡啶作为抗球虫药,而同时又会用到磺胺类药物,但至今未见氯羟吡啶同磺胺类兽药残留同时检测的相关报道。

种以六碳糖为底物的酶,不能酵解蔗糖作营养物质[6]。

而一种良好的稀释液,必须能供给作为能量来源的营养物质,所以稀释液中蔗糖完全不能替代果糖和葡萄糖的作用。

另外,已糖激酶对葡萄糖的亲和力大于果糖,并且已糖激酶是一个别构酶,易被其产物62磷酸葡萄糖强烈地别构抑制[6],所以精子分解葡萄糖的速度比果糖快,对精子的有害酸性程度要早,在保存时间上也就不如果糖[7]。

在含有同一种营养物质的稀释液中,精子的保存效果是/T ris>柠檬酸钾>ED TA0。

这主要缘于Tris 作为碱性缓冲物质,能使精液的p H值在一定程度上倾向于碱性,有利于提高精子活率[8],同时还可缓和稀释液中离子对精子的有害作用,且在高浓度时毒性也很低。

柠檬酸钾优于ED TA,这主要缘于柠檬酸钾向精液提供了一部分K+,而K+会延长精子的寿命,提高精子的活力[5];EDT A(乙二胺四乙酸二钠)虽是一种可逆性精子抑制剂,但由于稀释液中已有相当的谷氨酸钠与醋酸钠存在,N a+浓度过高,反面会影响精子活力。

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1材料与方法
111仪器与试剂
WATERS2695高效液相色谱仪,配有二极管阵列检测器和柱温箱;均质器;涡流混匀器;氮气浓缩装置;旋转蒸发仪;高速台式离心机;电子分析天平。

乙腈(色谱纯);冰醋酸;正己烷;氯仿;无水硫酸钠(500e灼烧4h,置于干燥器中备用);氯羟吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺262甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉标准品(Sig ma公司)。

112样品前处理
取2g混匀样品入15mL离心管中,加入10%硫酸钠水溶液015mL和414mL乙腈2氯仿混合溶剂(10+1)。

在涡流混匀器上剧烈混合后高速离心3 m in,将上清液转入第2支离心管。

用2mL乙腈2氯仿混合溶剂提取第1支离心管的残渣,高速离心3 m in后将提取液并入第2支离心管。

40e左右用氮气吹干,加入2%硫酸钠水溶液1mL和正己烷2mL后混匀、离心,移去己烷层,再用2mL正己烷洗水相,同法弃去己烷相。

分别向水相中加入3mL、2mL乙腈2氯仿(1+2),混匀、离心后吸取有机相转入第3支离心管中,40e以下蒸干。

以流动相定容至1mL,用针头过滤器过滤后供液相色谱测定。

113液相色谱条件
色谱柱:Sy mmetry C185L m(416mm@150 mm);检测器:2996二极管阵列检测器(DAD检测器);波长:270nm;进样量:20L L;柱温:30e;流动相:乙腈21%冰醋酸,采取梯度淋洗:流速018 mL/m i n,乙腈B1%冰醋酸为20B80,到8m i n,乙腈B1%冰醋酸为30B70,流速在1m i n内升到115 mL/m i n,并保持5m i n。

2结果与讨论
211色谱条件的选择
采用二极管阵列检测器能够得到每个组分的全波段紫外吸收谱图,取110mg/kg的各单标溶液,由二极管阵列检测器在200~350nm波长范围内扫描,9种药物的保留时间和最大吸收波长见表1。

选择270 n m作为H PLC的检测波长,从紫外吸收光谱图来看这9种药物都有比较好的吸收。

文献[4,9]中采用乙腈2磷酸盐缓冲液或者甲醇2水作为检测氯羟吡啶的流动相,而在检测磺胺类药物时多以乙腈2缓冲溶液或者甲醇2缓冲溶液作为流动相[6-7]。

我们选用乙腈2冰醋酸作为流动相,试验表明,冰乙酸的浓度为1%时色谱峰形较好且没有明显的拖尾现象。

乙腈与水的比例会影响保留时间,由于磺胺喹噁啉极性较小,ODS2C18色谱柱对其吸附较强,如按流动相乙腈21%冰醋酸(20%~80%)等梯度洗脱,保留时间需用时22m i n,且有明显拖尾现象。

本研究采用乙腈21%冰醋酸为流动相,采取合适的梯度淋洗条件,可以在保证氯羟吡啶和8种磺胺类药物各峰间分离度的情况下,缩短分析时间,并且峰形尖锐,峰对称性好(见图1)。

表19种药物的保留时间和最大吸收波长
药物名称保留时间/m i n最大吸收波长/nm
氯羟吡啶2157267
磺胺嘧啶3126258磺胺甲基嘧啶3194267
磺胺二甲基嘧啶4151267
磺胺甲氧嘧啶5139272
磺胺262甲氧嘧啶6184274
磺胺甲基异噁唑9104269
磺胺二甲氧嘧啶11110272磺胺喹噁啉11147
269
1.氯羟吡啶;
2.磺胺嘧啶;
3.磺胺甲基嘧啶;
4.磺胺二甲基嘧啶;
5.磺胺甲氧嘧啶;
6.磺胺262甲氧嘧啶;
7.磺胺甲基异噁唑;
8.磺胺二甲氧嘧啶;9.磺胺喹噁啉
图1标准品的色谱图
212样品前处理
文献[6-7]报道磺胺类药物的提取溶剂有氯仿或者乙腈,但氯仿有可能提取出类脂物,浓缩后不容易脱脂,而单纯采用乙腈提取回收率较低。

氯羟吡啶用乙腈、甲醇进行提取都有报道[4,9]。

选取乙腈2氯仿进行提取,回收率较单纯使用乙腈有所提高,而杂质也较单独使用氯仿有所减少。

在处理过程中加入无水硫酸钠可以有效防止样品中的水分及干扰成分进入提取液,同时硫酸钠的存在可促使蛋白质变性分散,
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畜牧与兽医2009年第41卷第3期
防止样品形成块状影响提取。

提取液经乙腈饱和正己
烷脱脂净化,可以脱去脂肪,减少杂质的干扰。

213 方法的线性关系
配制浓度为0102、0105、011、012、014、015、110L g /mL 的氯羟吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺262甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁标准混合溶液,取20L L 进样,测定峰面积,以峰面积对浓度作曲线,计算回归方程在0102~110L g /mL 含量范围内线形关系良好,结果见表2。

色谱峰高与质量浓度的相关系数(r)为019855~019999。

表2 9种药物的线性方程、相关系数
药 物线性方程
相关系数(r )
氯羟吡啶Y =(8199e+004)X +161019997磺胺嘧啶Y =(1159e+005)X -477019995磺胺甲基嘧啶Y =(9159e+004)X -5912019989磺胺二甲基嘧啶Y =(9111e+004)X -1150019971磺胺甲氧嘧啶Y =(1108e+005)X -814019996磺胺262甲氧嘧啶Y =(8148e+004)X -1020019983磺胺甲基异噁唑Y =(5135e+004)X +370019996磺胺二甲氧嘧啶Y =(4128e+004)X +1050019855磺胺喹噁啉
Y =(4110e+004)X -419
01
9932
214 实际样品的测定及方法检出限
在禽肉中分别添加015mg /kg 的氯羟吡啶和磺胺类药物标准溶液,每个水平平行做3份,同时做空白样品试验,在上述的色谱条件下分别得到空白样品和添加样品的色谱图(见图2、3),分别测定每种兽药残留的回收率以及标准偏差,同时得到方法的检出限(3倍基线噪音),结果见表3。

表3 样品加标回收率和检出限(n =3)
药物平均回收率/%
RSD %检出限/L g #kg -1
氯羟吡啶991731310磺胺嘧啶931111510磺胺甲基嘧啶881331410磺胺二甲基嘧啶8812
41210磺胺甲氧嘧啶921221410磺胺262甲氧嘧啶871621710磺胺甲基异噁唑871331510磺胺二甲氧嘧啶771221320磺胺喹噁啉
7117
318
20
3 结论
本试验研究了同时测定禽肉中氯羟吡啶和8种磺胺类药物残留的高效液相色谱法。

结果表明该方法准确、可靠、重现性高、检出限低,不仅能够完全满足日常的禽肉检测,而且同时测定的方法又特别适用于该类药物的残留监控,并为该类药物的进一步研究提供了帮助。

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