质粒构建实验步骤1

质粒构建实验步骤
实验一
1．将合成的引物溶解（10uM），分别扩增P1P2，P3P4，
2．PCR扩增条件如下：
95 ℃ 10 min
95 ℃ 30 s
50℃ 30 s 10cycle
72℃ 30 s
72℃ 5min
3.反应体系为：20 ul （p1p2和p3p4各两管）
dNTP 2 ul
10xBuffer 2ul
Taq 0.4 ul
Primer P1 （P3） 1.0 ul
Primer P2 （P4） 1.0 ul
H2O 13.6 ul
4．将产物电泳，检测是否为目标片断（分别为A1B、A2B）,证实为目的片断以后，进行后续扩增
5．将扩增出的AB和CD片断等摩尔加入作为模板进行第二次PCR，并且在第二次PCR 时加入引物扩增25个循环，PCR扩增条件如下：
95 ℃ 15 min
95 ℃ 30 s
60 ℃ 30 s 25cycle
72℃ 40 s
72℃ 5min
6．反应体系为：100ul
dNTP 10 ul
10xBuffer 10 ul
Taq 1ul
Product P1P2 2 ul
Product P3P4 2 ul
Primer F 1 ul
Primer R 1 ul
H2O 73ul
实验二
连接
载体DNA
外源DNA片段10×T4 DNA ligase buffer
T4 DNA ligase 0.5μl
16℃保温8-24小时。

做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。

实验三
10．转化
①取100ul感受态细胞置于冰上融化，将50ul感受态细胞加入至10ul连接产物中，冰上30min。

②42℃放置45~60s，冰上放置2~3min。

③加入37℃预温好的200ul LB液体培养基（不含Amp）
④37℃振荡培养1h（160~220 rpm）
11．铺板铺板之前要先将AMP抗性的LB固体培养基先预温到常温，然后取100 ul菌液涂板，37℃培养过夜（16~24h）
12．不带有质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。

挑选菌落接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

13. 取1 ul菌液进行菌落PCR。

（回收产物和水做对照）
PCR扩增条件如下：
95 ℃ 15 min
95 ℃ 30 s
（60）℃ 30 s 30cycle
72℃ 40 s
72℃ 5min
反应体系为：20ul
dNTP 2 ul
10xBuffer 2 ul
Taq 0.2 ul
菌液 1 ul
Primer F 0.4 ul
Primer R 0.4 ul
H2O 14 ul
14.2%琼脂糖凝胶电泳检测
15.取阳性克隆菌液送测序鉴定，结果正确后，提取质粒
质量要求：
1.测序图：与拼接的序列完全吻合（每个位点有两个质粒，有两张测序图）
2.质粒电泳图：（用P1和P4的上游引物和下游引物扩增）在电泳图上有两条较亮的条带：
一条为目的片断，另一条为两千多bp的超螺旋条带。

3.OD260/OD280的比值在1.8—2.0之间。

4.提取质粒的浓度不低于100ug/ml。