在间充质干细胞外泌体中过表达HIF-1α能通过提升血管再生能力增强心肌梗塞中对心肌的保护文献解读

文献解读：在间充质干细胞外泌体中过表达HIF-1α能通过提升血管再生能力增强心肌梗塞中对心肌的保护
心肌梗塞是目前世界上导致住院和死亡的主要原因，供血不足会导致心肌细胞的功能受损，进而导致心室衰竭，影响生活质量，增加死亡率。

因此，近年来，人们开始有恢复微血管，刺激血管再生的想法。

血管再生术是以之前形成的血管为基础的新血管形成的一个过程，但该方法在心肌梗塞中经常出现异常。

使受损的血管恢复是治疗的首选方案。

利用间充质干细胞(MSCs)进行细胞治疗是一种有前途的替代治疗策略，骨髓中的间充质干细胞会迅速动员到缺血的心脏部位促进血管生成和心脏修复。

最近研究表明，间充质干细胞的作用可能是通过细胞外囊泡(EV)发挥作用，这是一种外泌体，作为一个主要的亚型，已经得到了很大的研究。

外泌体是通过囊泡从胞浆中释放出来的纳米大小的颗粒，，一直都被认为是细胞传播的重要媒介，通过在细胞间转移各种生物活性物质参与免疫调节，增殖，细胞衰老和分化，活性物质有mRNAs、微RNA、蛋白质和脂质。

尽管外泌体的应用在许多动物模型中显示了良好的血管生成效果（如心肌梗死、伤口愈合和肢体缺血模型），但未修饰外泌体仅表现为中等的治疗效率，还需要通过基因工程改造来提高。

缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)被证明是缺氧反应基因表达中的一种关键转录调节因子，而且HIF-1α调节许多基因的表达，包括编码血管生成的细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)和血管生成素1(Ang-1)。

Li等人将能延迟降解的HIF-1型突变体转入缺血兔骨骼肌，观察到组织灌注得到改善，侧支血管增多，毛细血管更具组织学可识别性。

Gonzalez-King等人也证明了在基质胶塞实验中外泌体过表达HIF-1α通过增强Notch配体Jagged1诱导血管生成。

然而，HIF-1 -过表达的外泌体在缺血心脏中的血管生成作用机理尚不清楚。

苏州大学沈振亚课题组研究了MSC外泌体HIF-1α过表达对缺氧损伤的HUVECs和缺血性心肌病的影响。

结果表明外泌体能够提高缺氧损伤心肌细胞的迁移能力，血管生成和增值能力。

此外，HIF-1过表达的外泌体通过促进缺血边缘区新生血管的形成，对心肌梗死造成的心脏损伤表现出强保护作用。

基本信息
题目：
HIF-1αoverexpression in mesenchymal stem cell-derived exosomes mediates cardioprotection in myocardial infarction by enhanced angiogenesis
期刊：Stem Cell Research & Therapy
影响因子：5.2
PMID：32859268
作者：
Jiacheng Sun, Han Shen, Lianbo Shao, Xiaomei Teng, Y ueqiu Chen, Xuan Liu, Ziying Yang * and Zhenya Shen（沈振亚）
作者单位：苏州大学第一附属医院心血管外科&心血管科学研究所
摘要：心肌梗死是一种严重的疾病，常伴有血管生成障碍，利用骨髓间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体的细胞治疗心肌梗死已经得到了广泛的研究，因为它们具有强烈的促血管生成作用。

基因修饰是增强外泌体治疗效果最常用的方法之一。

该文主要研究了来自低氧诱导因子1- α (HIF-1 -α)修饰的间充质干细胞的外泌体的促血管生成和心脏保护作用。

结果分析
1．骨髓间充质干细胞和外泌体的特性研究
对大鼠骨髓间充质干细胞的形态和表面标志物进行了鉴定。

第1代和第3代细胞为典型的梭形。

流式分析显示CD29、CD90、CD73和CD105呈阳性，而CD45和CD11b呈阴性。

第3代MSCs用于慢病毒感染，超过90%的MSCs被慢病毒成功转化。

CCK-8检测证实慢病毒转导不影响细胞活力。

Western blot证实MSC HIF-1α蛋白水平增加。

同时，RT-qPCR表明，与MSC NC的外泌体相比，MSC HIF-1α的HIF-1α mRNA水平增加了约19.75倍。

用超速离心法从MSCs中分离外泌体。

纳米粒子追踪分析显示，外泌体的直径在50-200nm 之间，峰值为145.7nm。

透射电镜图像显示均匀的形态和经典的杯状外体。

分离的外泌体对表面标记物CD63和TSG101呈阳性，特别是在外泌体的膜上富集，对肌动蛋白呈阴性。

与
Exo组相比，Exo-HIF-1α组的HIF-1α表达水平也有所升高。

western blot检测两组中的HIF-1α蛋白水平：均未发现HIF-1α蛋白，表明基因修饰只改变了HIF-1 αmRNA的在外泌体中的表达。

2体外HUVECs血管受到缺氧造成损伤，使用外泌体改善了血管生成
为了研究外泌体对人脐静脉内皮细胞的影响，该研究首先用CM-DiI染料标记的外泌体与HUVECs共培养，HUVECs可以吸收外泌体（图1A）。

然后建立了缺氧损伤模型。

与PBS、Exo或Exo-HIF-1α、HIF-1α共培养48h后测定4组大鼠mRNA水平。

如图1b所示，缺氧预处理后HIF-1α表达水平降低，但可被Exo和Exo-HIF-1α弥补。

特别是-HIF-1α使HUVECs的HIF-1αmRNA水平比正常人高了1.74倍。

这表明外泌体可以作为载体将HIF-1αmRNA导入靶细胞。

然后检测HUVECs的体外血管生成能力。

如图1c所示，在HUVECs组和缺氧HUVECs+Exo-HIF-1α组能观察到大量的血管生产组织。

相比之下，缺氧huvcs几乎不能形成这些结构，Exo处理的缺氧huvcs只形成少数不完整的管状结构。

使用ImageJ软件分析了管长度和管浆数量，如图1d、e所示：缺氧培养后，管长度和管浆数均显著减少（管长度P<0.001；管浆P<0.01）。

与PBS治疗组相比，Exo给药可使管长度增加约1.83倍（P<0.01），但该组未能增加管浆数（P=0.2467）。

Exo-HIF-1α共培养提高了试管长度和管浆数，并表现出比Exo组更好的保护作用。

3.外泌体可上调促血管生成因子的表达水平
对编码血管生成因子的基因进一步研究为上述表型提供了可能的解释，缺氧损伤后VEGF、
Ang-1和PDGF的mRNA表达均降低，使用Exo-HIF-1α则可上调相关基因表达（图2a-c）。

ELISA实验显示：VGEF的分泌呈现出与其mRNA水平相似的模式（图2d）。

Ang-1的蛋白水平与其mRNA水平一致（图2e）。

缺氧损伤对PDGF mRNA的翻译无影响，但HIF-1α可增加HUVECs中PDGF的分泌（图2f）。

4.Exo-HIF-1α可提升缺氧预处理HUVECs的迁移能力
采用Transwell实验研究外泌体对HUVECs迁移能力的调节作用。

如图3所示，缺氧培养48h 后，HUVECs的迁移能力显著受损（HUVECs 431.00±73.90/HPF vs.缺氧HUVECs 29.49±17.59/HPF；P<0.01）。

但在缺氧条件下，无论是Exo还是Exo-HIF-1α的共培养都可以保存其迁移能力。

Exo-HIF-1α组比Exo组具有更大的保护作用（缺氧HUVECs+Exo-HIF-1α298.30±129.2 vs.缺氧HUVECs+Exo组91.27±43.27；P<0.05）。

此外，虽然Exo-HIF-1α组的迁移细胞数少于HUVEC组，但统计学分析无显著性差异，表明Exo-HIF-1α保留了HUVEC在缺氧损伤时的迁移能力。

5.Exo和Exo-HIF-1α可促进缺氧预处理HUVECs的增殖能力
使用EdU染色法研究不同外泌体对预处理HUVECs增殖的影响（图4a）。

缺氧预处理后EdU 阳性细胞比例明显下降，用Exo或Exo-HIF-1α处理后EdU阳性细胞比例增加。

，Exo-HIF-1α处理的HUVECs组与HUVEC组相比EdU阳性率相似，说明Exo-HIF-1α能够完全保护增殖细胞缺氧损伤下的反应能力（图4b）。

6.Exo-HIF-1α对大鼠心肌梗死模型心功能的保护作用
在细胞移植后3、14和28天用超声心动图测量左室静脉内径、舒张末期和末期系统（LVIDd 和LVIDs）、左心室射血分数（EF）和左室短缩参数（FS）（图5a），PBS组LVIDd和LVIDs 均呈时间依赖性增加。

Exo和Exo-HIF-1α的应用明显限制了左心室的扩张，与PBS组和Exo 组相比，Exo-HIF-1α组的LVEF和LVFS也有增加（图5d，e）。

这一发现与组织学分析一致（图6）。

7.Exo-HIF-1α降低梗死心脏纤维化
该研究在组织学上评估了外泌体对心肌梗死的保护作用。

从H&E染色结果观察到心肌梗死后28天，梗死心脏发生纤维化和重塑，以替换坏死的心肌细胞（图6a）。

采用Masson三色染色法测量28天后梗死组织的大小。

图像显示纤维化区域呈蓝色，完整心肌呈红色（图6b）。

定量分析显示Exo和Exo-HIF-1α组左室横截面积的纤维化面积百分比和内部纤维化长度均显著减小（图6c，d）。

Exo-HIF-1α治疗效果更好。

8.Exo-HIF-1α促进梗死心脏血管生成
通过免疫组化检测缺血边缘区血管生成情况。

免疫荧光剂凝集素用于标记内皮细胞（图7a）。

总的来说，与PBS和Exo相比，Exo-HIF-1α组的血管生成能力增强（图7b），表明HIF-1α诱导的心脏保护是由其促血管生成能力介导的。

与空白组相比，PBS组和Exo组HIF-1α表达水平轻度上调，分别为1.23倍和1.31倍。

Exo-HIF-1α组，HIF-1α的表达水平与其他3组相比有显著提高（图8a）。

进一步的研究显示，大多数血管生成相关的mRNAs和蛋白质在心肌梗死后第7天升高。

在我们的体外实验中其中三个基因在缺血边缘区都被HIF-1α上调（图8b-d）。

然而，心肌梗死7天后大鼠外周血中只有VEGF和PDGF蛋白水平被HIF-1α升高（图8e，g）。

Ang-1表达水平无统计学差异（图8f）。

结论：本研究揭示了Exo-HIF-1α对缺血心脏的血管生成和心脏保护作用是通过VEGF和PDGF介导的。

缺氧损伤的HUVECs的血管生成、增殖和迁移可被Exo-HIF-1α提升。

总之，HIF-1α在外泌体中的过表达对心肌梗死的有治疗作用，可作为治疗心肌梗死的潜在方法。