动物组织RNA提取及荧光定量PCR精讲
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2）取5μl RNA（200 ng/μl）至一个小 EP管中，以供电泳使 用。
（注：剩余部分于-80℃保存备RT反应用）
3）将上步的RNA 70℃加热2 min。
4）冰上冷却。RNA提取概要RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
2、质量检测—凝胶电泳法
实验操作：
5）向每管中加入1μl 6×Loading Buffer，混合均匀。 6）将琼脂糖凝胶放入到电泳槽中。 7）导入1×TAE Buffer，完全浸过胶面。 8）点样：将管内样品全部加入到一个凝胶孔里。 9）电泳：100-120V，约20-30分钟。 10）凝胶成像。
RNA提取
概要
RNA的提取步骤
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
11、将上层水相溶液小心转移至新的EP管中， 大约每个EP管中能取出400~500μl，谨慎操作， 切勿吸到中间层。
（注：下层有机废液勿乱丢，收集起来统一进行无毒化处理。）
12、加入等体积异丙醇，上下颠倒EP管，充分 混匀。
13、室温静置10 min后，4℃，13000rpm离心 10 min。可在离心后的EP管底部观察到少量的 白色沉淀。
若有条带，可能混 入了基因组DNA
利 用 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 ， 如果可以清晰观察到两条rRNA条 带（真核生物：28S和18S；原核 生物：23S和16S），且其浓度比 值大约为2:1，则RNA未降解。
28S rRNA 18S rRNA
tRNA等
若观察到smear现象，或比值小
注意事 项总结
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA的提取步骤
8、每1ml液体中加入1/5体积（约200μl）的氯 仿，盖紧EP管，用手剧烈震荡15秒，直至溶液 充分乳化，无分相现象。（注：不能用振荡器混匀，
因为容易造成DNA和RNA的物理降解。）
9、室温静置5 min，4℃，13000rpm离心15 min。 10、从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分 为三层，上层是透明的水层，RNA溶解在此层 中；半固体状的中间层，此层 中包含DNA；下层为粉红色的 有机溶剂，蛋白质、多糖等物 质溶解在此层中。
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
2、质量检测—凝胶电泳法
实验操作：
1）取10μl RNA原液至一个1.5ml EP管中，使用RNase-free ddH2O将其稀释至200ng/μl。
注 ： 需 RNase-free ddH2O 体 积 (μl)=[10μl×RNA 浓 度 (ng/μl) /200(ng/μl)]10μl
RR
Q
Q
3’
5’
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
QPCR
Q-PCR
注意事 项总结
注意事项总结 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
常见问题及疑难解答
提取RNA收率低
当收率明显低于预期时，可以考虑以下原因： 1）加入Trizol或RNAiso Plus后样品匀浆不充分； 2）分层时水相回收率低； 3）RNA沉降后与水复溶性不好； 4）异丙醇沉降或洗涤过程中混入Rnase。
于2:1，则RNA已发生降解。
DL2000 DNA Marker
如果观察到大于28S或23S的条带， 电泳图（1%琼脂糖胶，TAE）
则样品可能有基因组DNA污染，
这时可以考虑使用DNase I处理。
RNA提取
概要
RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
2、质量检测—凝胶电泳法
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA的提取步骤
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
18、打开EP管，室温放置干燥（目的是让残留 的乙醇挥发，乙醇的残留可能对后续的反应有 影响）。干燥的时间不宜太久，RNA完全干燥 后很难溶解
19、用RNase-free ddH2O溶解沉淀。（视RNA 量的多少所加RNase-free ddH2O的体积从20200不等，肝脏组织RNA产率较高，肺组织产 率低）
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
RNA的提取步骤
5、向研磨成粉末状的样品中加入1ml RNAiso Plus，并完全覆盖样品。（注：在加入RNAiso Plus时
要保证组织没有融化，否则RNA易被RNase降解。）
6、室温静置5~10 min。
7、待样品融化后，用研杵继续研磨至裂解液 呈透明状。将匀浆液转移至1.5ml EP管中，室 温静置5 min后，4℃，13000rpm离心5 min， 将上清转移至新的1.5ml EP管中。
RNA 提取
RT-PCR
反转录（RT）反应
实验操作：
1）RT-PCR程序：
37℃, 15min
85℃, 5s
反转录过程
使反转录酶失活
4℃, ∞
Q-PCR
注意事 项总结
得到的cDNA短期可在4℃保存数 天，长期保存应在-20℃以下
荧光定量PCR（Q-PCR）
概要
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时在 线监测整个反应进程，并结合相应的软件对未知模板进行
20、RNA溶液保存在-80℃冰箱中。
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
1、浓度及纯度检测：
（Thermo SCIENTIFIC NANODROP 1000 Spectrometer ）
核酸在260nm附近有强吸收，蛋白质在280nm附近有强 吸收。所以测定溶液在260nm和280nm下的吸光度，根 据A260计算提取的核酸量，根据A260/A280的比值评价提取 的核酸纯度。
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA的提取步骤
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
14、小心弃去上清。
15、 向含 有沉淀的 EP管中缓缓 加入 1ml预 冷 75%乙醇，轻轻上下颠倒，清洗沉淀。（动作 轻柔，无需将沉淀悬浮起来）
16、4℃，13000rpm离心5 min。用移液器除去 上清。
17、将EP管瞬时离心，用移液器仔细将残存在 EP管底部的少量液体除去。
定量分析的方法。
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
QPCR
下面介绍动物组织Total RNA的提取方法
RNA提取 概要
实验材料
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
1、组织（以小鼠肝脏为例） 2、RNAiso Plus（Code No: 9108）（作用同
TRIzol） 3、其他：氯仿、异丙醇、75%乙醇、研钵、加
样器、1.5ml EP管、枪头等。（均为RNasefree）
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA的提取步骤
1、从小鼠体内取出肝脏，用预冷的生理盐水 清洗。
2、使用液氮迅速冷冻组织， -80℃冰箱保存。
3、使用液氮充分预冷研钵。 4、将称重冷冻的组织（约50-100mg）从冰箱 取出后迅速放入预冷好的研钵中，用研杵研磨 组织，期间不断加入液氮，直至组织被研磨成 粉末状。（注：无明显的可见颗粒，如果研磨 不彻底会影响RNA的收率和质量。）
理想的RNA纯度A260/A280应在1.8~2.2范围内。 低 离 子 强 度 或 低 pH 值 会 使 OD280 升 高 ， 从 而 使 OD260/OD280值低（<1.65）
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA的浓度及质量检测 2、质量检测—凝胶电泳法
0.1%DEPC水
有毒
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
准备工作
戴口罩、手套、帽子 提取区域：用75%乙醇擦拭试验台 试验器具：用75%乙醇擦拭加样枪
准备RNase-free的枪头和离心管 低温离心机预冷至4℃ 准备-20℃预冷的75%乙醇
注意事 项总结
RNA提取 概要
RNA 提取
实验材料：
a. 提取的RNA溶液 b. DL2000 DNA Marker c. 6×Loading Buffer d. 1%的琼脂糖凝胶（加1μl Goldview/20ml凝胶） e. 1×TAE Buffer f. 电泳仪 g. UV凝胶成像仪
RNA提取
概要
RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
注意事 项总结
注意事项总结 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
常见问题及疑难解答
提取的RNA难以溶解
1）75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥； 2）若难溶可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。
注意事 项总结
注意事项总结
概要
常见问题及疑难解答
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
提取的RNA降解
1）提取RNA应采用新鲜的组织材料，或者用液氮迅速冷冻 后置于-80℃保存的组织材料。
2）提取RNA使用的试剂及器具中可能混有Rnase；
3 ） 提 取 的 组 织 材 料 中 含 有 大 量 的 Rnase ， 提 取 时 应 提 高 Trizol或RNAiso Plus的使用量。
RNA提取
概要
RNA产率估计
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
组织材料 肝 脑 肾
骨骼肌 HL-60 白细胞
部分组织的RNA产率估计
样品量
Total RNA收率
1g
约5000μg
1g
约1500μg
1g
约3000μg
1g
约1500μg
1×107细胞
约100μg
1×107细胞
约20-40μg
注意事 项总结
4）RNA提取应有专门的区域，使用无酶的枪头、EP管，带 口罩、帽子、手套，并在操作中更换新手套。跑电泳时每 次将槽子洗干净，换新的TAE缓冲液。
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Thank you!
Q-PCR
注意事 项总结
宋志新 Tel：15922761761
谢谢观赏
动物组织RNA提取及荧光定量PCR精讲
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
利用含有变性剂和Rnase抑制剂的有机溶剂提取RNA，是 目前常用的RNA提取方法。
Trizol（主要成分为异硫氰酸胍和酚），具有极强的裂解 能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，保持样品中 RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。样品在Total RNA Extraction Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心 后，溶液会形成上清层、中间层和有机层 (鲜红色下层)， RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀 便可以回收得到Total RNA。提取的总RNA纯度高，基本 不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可直接用于 Northern，点杂交，mRNA纯化，体A Extraction Reagent广泛适用于培养细胞、动物 组织、微生物等。
2）配反应体系（注意：不同的试剂盒体系不同，我们用的是TaKaRa
的RR037A） 20μl体系
5x Buffer
4μl
Oligo dT Primer 1μl
Random 6 mers 1μl
DEPC H2O
1μl
Enzymermix
1μl
提取的RNA模板 2μl
逆转录PCR（RT-PCR） 概要
Q-PCR
注意事 项总结
双标记探针（Taqman Probe）
荧光报告基团 5‘
（Reporter）
寡核苷酸探针
3‘ 荧光淬灭基团
（Quencher）
序列特异性
➢ 游离状态下，FRET效应，不发荧光 ➢ 伴随产物生成，荧光积累
双标记探针（Taqman Probe）
5’
3’
5’
3’
3’
5’
Excitation Excitation
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
巨噬细胞RNA 动物组织RNA
巨噬细胞RNA
RNA降解
逆转录PCR（RT-PCR）
概要
反转录（RT）反应
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA自身不能作为PCR反应的模板，所以必须先将其反转录为cDNA。
实验操作：
1）将提取的RNA调整浓度为500ng/μl，并于70℃变性2min。
（注：剩余部分于-80℃保存备RT反应用）
3）将上步的RNA 70℃加热2 min。
4）冰上冷却。RNA提取概要RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
2、质量检测—凝胶电泳法
实验操作：
5）向每管中加入1μl 6×Loading Buffer，混合均匀。 6）将琼脂糖凝胶放入到电泳槽中。 7）导入1×TAE Buffer，完全浸过胶面。 8）点样：将管内样品全部加入到一个凝胶孔里。 9）电泳：100-120V，约20-30分钟。 10）凝胶成像。
RNA提取
概要
RNA的提取步骤
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
11、将上层水相溶液小心转移至新的EP管中， 大约每个EP管中能取出400~500μl，谨慎操作， 切勿吸到中间层。
（注：下层有机废液勿乱丢，收集起来统一进行无毒化处理。）
12、加入等体积异丙醇，上下颠倒EP管，充分 混匀。
13、室温静置10 min后，4℃，13000rpm离心 10 min。可在离心后的EP管底部观察到少量的 白色沉淀。
若有条带，可能混 入了基因组DNA
利 用 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 ， 如果可以清晰观察到两条rRNA条 带（真核生物：28S和18S；原核 生物：23S和16S），且其浓度比 值大约为2:1，则RNA未降解。
28S rRNA 18S rRNA
tRNA等
若观察到smear现象，或比值小
注意事 项总结
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA的提取步骤
8、每1ml液体中加入1/5体积（约200μl）的氯 仿，盖紧EP管，用手剧烈震荡15秒，直至溶液 充分乳化，无分相现象。（注：不能用振荡器混匀，
因为容易造成DNA和RNA的物理降解。）
9、室温静置5 min，4℃，13000rpm离心15 min。 10、从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分 为三层，上层是透明的水层，RNA溶解在此层 中；半固体状的中间层，此层 中包含DNA；下层为粉红色的 有机溶剂，蛋白质、多糖等物 质溶解在此层中。
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
2、质量检测—凝胶电泳法
实验操作：
1）取10μl RNA原液至一个1.5ml EP管中，使用RNase-free ddH2O将其稀释至200ng/μl。
注 ： 需 RNase-free ddH2O 体 积 (μl)=[10μl×RNA 浓 度 (ng/μl) /200(ng/μl)]10μl
RR
Q
Q
3’
5’
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
QPCR
Q-PCR
注意事 项总结
注意事项总结 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
常见问题及疑难解答
提取RNA收率低
当收率明显低于预期时，可以考虑以下原因： 1）加入Trizol或RNAiso Plus后样品匀浆不充分； 2）分层时水相回收率低； 3）RNA沉降后与水复溶性不好； 4）异丙醇沉降或洗涤过程中混入Rnase。
于2:1，则RNA已发生降解。
DL2000 DNA Marker
如果观察到大于28S或23S的条带， 电泳图（1%琼脂糖胶，TAE）
则样品可能有基因组DNA污染，
这时可以考虑使用DNase I处理。
RNA提取
概要
RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
2、质量检测—凝胶电泳法
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA的提取步骤
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
18、打开EP管，室温放置干燥（目的是让残留 的乙醇挥发，乙醇的残留可能对后续的反应有 影响）。干燥的时间不宜太久，RNA完全干燥 后很难溶解
19、用RNase-free ddH2O溶解沉淀。（视RNA 量的多少所加RNase-free ddH2O的体积从20200不等，肝脏组织RNA产率较高，肺组织产 率低）
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
RNA的提取步骤
5、向研磨成粉末状的样品中加入1ml RNAiso Plus，并完全覆盖样品。（注：在加入RNAiso Plus时
要保证组织没有融化，否则RNA易被RNase降解。）
6、室温静置5~10 min。
7、待样品融化后，用研杵继续研磨至裂解液 呈透明状。将匀浆液转移至1.5ml EP管中，室 温静置5 min后，4℃，13000rpm离心5 min， 将上清转移至新的1.5ml EP管中。
RNA 提取
RT-PCR
反转录（RT）反应
实验操作：
1）RT-PCR程序：
37℃, 15min
85℃, 5s
反转录过程
使反转录酶失活
4℃, ∞
Q-PCR
注意事 项总结
得到的cDNA短期可在4℃保存数 天，长期保存应在-20℃以下
荧光定量PCR（Q-PCR）
概要
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时在 线监测整个反应进程，并结合相应的软件对未知模板进行
20、RNA溶液保存在-80℃冰箱中。
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
1、浓度及纯度检测：
（Thermo SCIENTIFIC NANODROP 1000 Spectrometer ）
核酸在260nm附近有强吸收，蛋白质在280nm附近有强 吸收。所以测定溶液在260nm和280nm下的吸光度，根 据A260计算提取的核酸量，根据A260/A280的比值评价提取 的核酸纯度。
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA的提取步骤
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
14、小心弃去上清。
15、 向含 有沉淀的 EP管中缓缓 加入 1ml预 冷 75%乙醇，轻轻上下颠倒，清洗沉淀。（动作 轻柔，无需将沉淀悬浮起来）
16、4℃，13000rpm离心5 min。用移液器除去 上清。
17、将EP管瞬时离心，用移液器仔细将残存在 EP管底部的少量液体除去。
定量分析的方法。
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
荧光定量PCR（Q-PCR） 概要
RNA 提取
RT-PCR
QPCR
下面介绍动物组织Total RNA的提取方法
RNA提取 概要
实验材料
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
1、组织（以小鼠肝脏为例） 2、RNAiso Plus（Code No: 9108）（作用同
TRIzol） 3、其他：氯仿、异丙醇、75%乙醇、研钵、加
样器、1.5ml EP管、枪头等。（均为RNasefree）
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA的提取步骤
1、从小鼠体内取出肝脏，用预冷的生理盐水 清洗。
2、使用液氮迅速冷冻组织， -80℃冰箱保存。
3、使用液氮充分预冷研钵。 4、将称重冷冻的组织（约50-100mg）从冰箱 取出后迅速放入预冷好的研钵中，用研杵研磨 组织，期间不断加入液氮，直至组织被研磨成 粉末状。（注：无明显的可见颗粒，如果研磨 不彻底会影响RNA的收率和质量。）
理想的RNA纯度A260/A280应在1.8~2.2范围内。 低 离 子 强 度 或 低 pH 值 会 使 OD280 升 高 ， 从 而 使 OD260/OD280值低（<1.65）
注意事 项总结
RNA提取
概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA的浓度及质量检测 2、质量检测—凝胶电泳法
0.1%DEPC水
有毒
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
准备工作
戴口罩、手套、帽子 提取区域：用75%乙醇擦拭试验台 试验器具：用75%乙醇擦拭加样枪
准备RNase-free的枪头和离心管 低温离心机预冷至4℃ 准备-20℃预冷的75%乙醇
注意事 项总结
RNA提取 概要
RNA 提取
实验材料：
a. 提取的RNA溶液 b. DL2000 DNA Marker c. 6×Loading Buffer d. 1%的琼脂糖凝胶（加1μl Goldview/20ml凝胶） e. 1×TAE Buffer f. 电泳仪 g. UV凝胶成像仪
RNA提取
概要
RNA的浓度及质量检测
RNA 提取
注意事 项总结
注意事项总结 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
常见问题及疑难解答
提取的RNA难以溶解
1）75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥； 2）若难溶可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。
注意事 项总结
注意事项总结
概要
常见问题及疑难解答
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
提取的RNA降解
1）提取RNA应采用新鲜的组织材料，或者用液氮迅速冷冻 后置于-80℃保存的组织材料。
2）提取RNA使用的试剂及器具中可能混有Rnase；
3 ） 提 取 的 组 织 材 料 中 含 有 大 量 的 Rnase ， 提 取 时 应 提 高 Trizol或RNAiso Plus的使用量。
RNA提取
概要
RNA产率估计
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
组织材料 肝 脑 肾
骨骼肌 HL-60 白细胞
部分组织的RNA产率估计
样品量
Total RNA收率
1g
约5000μg
1g
约1500μg
1g
约3000μg
1g
约1500μg
1×107细胞
约100μg
1×107细胞
约20-40μg
注意事 项总结
4）RNA提取应有专门的区域，使用无酶的枪头、EP管，带 口罩、帽子、手套，并在操作中更换新手套。跑电泳时每 次将槽子洗干净，换新的TAE缓冲液。
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
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Q-PCR
注意事 项总结
宋志新 Tel：15922761761
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动物组织RNA提取及荧光定量PCR精讲
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
利用含有变性剂和Rnase抑制剂的有机溶剂提取RNA，是 目前常用的RNA提取方法。
Trizol（主要成分为异硫氰酸胍和酚），具有极强的裂解 能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，保持样品中 RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。样品在Total RNA Extraction Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心 后，溶液会形成上清层、中间层和有机层 (鲜红色下层)， RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀 便可以回收得到Total RNA。提取的总RNA纯度高，基本 不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可直接用于 Northern，点杂交，mRNA纯化，体A Extraction Reagent广泛适用于培养细胞、动物 组织、微生物等。
2）配反应体系（注意：不同的试剂盒体系不同，我们用的是TaKaRa
的RR037A） 20μl体系
5x Buffer
4μl
Oligo dT Primer 1μl
Random 6 mers 1μl
DEPC H2O
1μl
Enzymermix
1μl
提取的RNA模板 2μl
逆转录PCR（RT-PCR） 概要
Q-PCR
注意事 项总结
双标记探针（Taqman Probe）
荧光报告基团 5‘
（Reporter）
寡核苷酸探针
3‘ 荧光淬灭基团
（Quencher）
序列特异性
➢ 游离状态下，FRET效应，不发荧光 ➢ 伴随产物生成，荧光积累
双标记探针（Taqman Probe）
5’
3’
5’
3’
3’
5’
Excitation Excitation
RNA提取 概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
巨噬细胞RNA 动物组织RNA
巨噬细胞RNA
RNA降解
逆转录PCR（RT-PCR）
概要
反转录（RT）反应
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事 项总结
RNA自身不能作为PCR反应的模板，所以必须先将其反转录为cDNA。
实验操作：
1）将提取的RNA调整浓度为500ng/μl，并于70℃变性2min。