绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
背景知识
绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅
和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子。

发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。

1996 年 GFP 的晶体结构被解
出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中
心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光
活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内
部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .
实验一质粒DNA 的分离与纯化
一、实验目的
掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。

该法用
于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的
质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。

二、基本原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到
200kb 。

质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地
整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

在大多
数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制
10-200 个拷贝。

当宿主细胞的蛋白
时所用的酶是相同的。

有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。

借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。

目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒 DNA 的分离；质粒 DNA 的纯化。

1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。

对于松弛型质粒（如 pUC 系列）来说，只要将培养物放到标准的 LB 或 2YT 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒 DNA 。

但对于严谨型质粒（如 pBR322 ）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。

2、菌体的收集、裂解和质粒DNA 的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株） DNA 与质粒 DNA 之间的两种主要性质差异：（ 1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA 大得多。

（ 2）从细胞中提取得
到的大肠杆菌 DNA 主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA 是共价闭合的环状分子。

这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH 使菌体
裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。

此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。

当条件恢复正常时（如加入酸性的 NaAc 或 Kac 中和碱性 NaOH ），质粒 DNA 链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。

通过离心，可以使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。

3、质粒 DNA 的提纯
胶电泳中不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。

其中走在
最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和 OC DNA 。

三、实验材料、仪器及试剂
1. 在含有 pEGFP －N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种， 置于含有 5mL LB 培养基
的试管中。

摇晃过夜。

（DH5α是一种大肠杆菌的诱变菌株，主要表现对外源 D NA 的免疫缺乏，是用
于基因工程的菌种）
在含有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。

2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱
四、实验步骤
1. 取1.5ml DH5 α培养液倒入 1.5mL eppendorf 管（一种离心管） 中, 13000rpm 离心1min 。

对于小量制备的质粒 DNA ，经过苯酚抽提、 蛋白质及 RNA ，达到纯化的目的。

质粒 DNA 分子具有三种构型：共价闭合
环形 构型）和线性分子（ L 构型）。

在细RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残
余
DNA （cccDNA ，SC 构型）、开环 DNA （ OC
2. 重复 1。

3.弃上清 ,将管倒置于卫生纸上数分钟 ,使液体流尽。

4.菌体沉淀重悬浮于 100 μL溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）, 室温下放置 10min。

（溶液I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ；溶液I的作用；mM为mmol/L。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当 pH值的 Tris-Cl 溶液。

50
mM葡萄糖最大的好处是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

EDTA是 Ca2+和Mg2+等二
价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物
生长。

在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

）
5.加入新配制的溶液Ⅱ 200μ l, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管5次 ,以混
匀内容物（千万不要振荡）,冰浴 5min 。

（溶液 II ，0.2 M NaOH / 1% SDS ；溶液 II 的作用；这是用新鲜的 0.4 N 的NaOH和2％的 SDS等体积混合后使用的。

要新从浓 NaOH稀释制备 0.4N的NaOH，保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱碱性。

其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。

用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。

这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。

）
6.加入 150 μL预冷的溶液Ⅲ ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次 ,使沉淀混匀 ,冰浴中 15分
钟,13000rpm 离心 5min。

（溶液 III ，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。

溶液Ⅲ含 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸。

溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，这其实是 SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而 PDS是水不溶的，因
此发生了沉淀。

而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合
一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。

大肠杆菌的基因组DNA也会一起被共沉淀，因为基因组 DNA太长，容易被 PDS共沉淀，注意SDS并不与 DNA分子结合。

2M的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。

基因组DNA一旦
发生断裂，只要是 50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。

所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以
观察到一条浓浓的总 DNA条带。

很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。

NaOH
本来是为了溶解细胞而用的， DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。

溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

）
7.上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的氯仿 /异戊醇（24 ： 1）,振荡混
匀 , 13000rpm离心 2min。

（PDS沉淀的形成后有些蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 / 氯仿/ 异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase而发生降解。

这里用 25： 24： 1的酚/ 氯仿/ 异戊醇是有很多道理的。

酚（ Phenol ）
对蛋白质的变性作用远大于氯仿，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到
上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚 / 氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），而用酚 / 氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

）
8.将水相移入干净 eppendorf 管中 ,加入等体积的氯仿 / 异戊醇（24： 1）振荡混
匀 , 13000rpm离心 2min。

9.将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇 ,振荡混匀后，置于室温
下 2min，然后 13000rpm离心 5min 。

（回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。

）
10.弃上清 ,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL 70 ％乙醇洗沉淀一次 , 振荡混
匀后， 13000rpm 离心 5min 。

（高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。

如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用移液枪枪头（tip ）将沉淀打碎，就能得到好的样品。

）
11.吸除上清液 ,将管倒置于卫生纸上使液体流尽 ,室温干燥。

12.将沉淀溶于 30μL TE缓冲液（pH8.0 ，含20μ g/mL RNaseA）中，保存在 -20℃冰
箱中。

（溶解已经讲解的 RNA，防止未降解的 RNA会干扰电泳结果。

）
13.按照同样的流程和方法将 pET-28a 的质粒也提出来，保存在 -20℃冰箱中。

五、实验结果
实验二质粒 DNA浓度的测定
、实验目的
学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。

、基本原理
核酸分子在 260nm 下有最大吸光值，因此可以通过 260nm 下核酸的吸光值计算核酸浓度mg/ml ），并通过测定与 280nm 和 230nm 的比值，估算 DNA 的纯度。

除了核酸浓度 , 分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度 ,如 A 260 / A 280
的比值 ,用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm. 纯净的样品 , 比值大于
1.8 （DNA）
或者 2.0 （ RNA）。

如果比值低于 1.8 或者 2.0 ，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物, 多肽 , 苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比
值大于 2.0 。

A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。

纯样品， A 320 一般是
0 。

）
三、实验材料与仪器
1、实验材料
pEGFP－ N3和pET-28a DNA
2.使用仪器
Eppendorf 核酸蛋白测定仪，移液枪
四、实验步骤
1.按下 Eppendorf 核酸蛋白测定仪 dsDNA ，比色皿中加入 100μl ddH2O，blank 空白对照。

2.取一 0.5ml 离心管，吸取质粒 DNA 5 μ l，然后再加入 95μl ddH 2O，混匀。

3.将 100μl 的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡。

4.按下 sample ，记录 260nm 下 DNA 的浓度（ mg/ml ）。

并同时记录 OD
260nm/280nm，
OD260nm/230nm 的比值，估测 DNA的纯度。

5.计算质粒 DNA 母液的浓度 =OD260nm 下的浓度× 20（ mg/ml ），
DNA的纯度： OD260nm/280nm=1.8±0.1（如果低于 1.7 ，说明样品中蛋白质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果高于 1.9 ，说明样品中 RNA去除的不完全。

）正常 OD260nm/230nm 约为 2.5， OD 260nm/230nm 小于 2.0 ，表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物 , 多肽 , 苯酚等盐和小分子。

实验三琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化 DNA 片段的比较方便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。

二、基本原理
影响 DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（ 1）DNA分子的大小双链 DNA 分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。

分子越大，迁移的越
慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。

（2）琼脂糖浓度给定大小的线
状 DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。

在 DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度
之间存在线性相关。

（ 3）DNA的构象超螺旋环状（Ⅰ型）、切口环状（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型） DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。

其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度。

一些条件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。

（4）所用的电压低电压时， DNA 片段迁移
率与所用的电压成正比。

电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。

所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。

要获得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，
所用电压不应高于 5-8V/cm 。

（5）电泳缓冲液 DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。

缺乏离子则电导率降低， DNA或者不动或者迁移很慢。

高离子强度时（如
10×
buffer ），电
导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。

三、实验材料、仪器及试剂
1、实验材料
质粒 DNA
2、使用仪器
核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪
四、实验步骤
1、1% 琼脂糖凝胶的配制
（1）加 20ml 1×TBE 缓冲液于三角瓶中。

（TBE缓冲液为 Tris 硼酸 -EDTA缓冲溶液，适合长时间电泳，但测得分子质量大于实际分子质量，； TAE缓冲液为 Tris 醋酸 -EDTA缓冲溶液，运用最广泛，较准确但不适合长时间； TPE缓冲液为 Tris 磷酸 -EDTA 缓冲溶液，磷酸盐易在乙醇沉淀
过程中析出，不适合DNA回收。

）
（ 2）精确称取 0.2g 琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，
（ 3）冷却至 60℃左右，
（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30 分钟以上，
（5）将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE ）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，
（6）取 5μl 质粒 DNA 及 2μl Genefinder 混匀上样。

（也可使用 GelRed荧光核酸凝胶染色试剂，用凝胶成像仪显影）
（7）50-100v 约电泳 0.5-1 小时。

（8）蓝盾可见光透射仪观察结果。

五、实验结果
实验四酶切及连接学习使用限制型内切酶进行 DNA酶切的原理和方法。

1. 实验目的
3.1 实验材料
2. 实验原理
迄今已发现了 3000 多种限制性内切酶。

传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、 识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。

II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地 切开 DNA 链。

它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于 DNA 分析和克隆
的一类。

II 型限制性内切酶中最普遍的是象 EcoR I 、Hind III 、 BamHI 和 Not I 这样在识别序列中 进行切割的酶。

这一类酶是构成商业化酶的主要部分。

大部分这类酶都以同二聚体的形式结合
到 DNA 上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到 D NA 上，识别非对称序列。

一些酶识别连续的序列（如 EcoR I 识别 GAATTC ；Hind III 识别 AAGCTT;BamH 识I 别 G ↓ GATCC;
Not I 识别 GC ↓ GGCCG ）C ；而另一些识别不连续的序列（如 Bgl I 识别 GCCNNNNNG ）G 。

C 限制
性内切酶酶切 DNA 后形成两种类型的末端： （i ） 两条链断裂的位置是交错地， 产生粘性末端，如
DNA 连接酶能够催化在两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条 DNA 链的 3'-
EcoR I 酶切后产生
5' -G ↓AATTC-3'
3' -CTTAA ↓G-5' 末端；（ii ） 两条链的断裂位置处在一个对称结构 的中心，产生平末端，如 HaeIII 酶切后产生
5' -GG ↓ CC-3'
3' -CC ↓ GG--P ）。

3.实验材料、仪器及试剂
pEGFP－N3和pET-28a DNA 3.1 实验材料
3.2 仪器准备水浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射
仪、凝胶成像仪
3.3 试剂
BamH I（10U/ μ L）（TaKaRa公司）; Not I （10U/ μ L）（TaKaRa公司）,T4 ligase
4.操作步骤
4.1 酶切
按如下双酶切体系（ 30μL）混合：
反应物（μ L）pEGFP-N3 pET-28a
质粒18 18
BamH I 2 2
Not I 2 2
10×buffer K 3 3
0.1%BSA缓冲液 3 3
（BSA缓冲液为牛血清白蛋白，稳定酶的活性。

）
1. 离心 10s，混匀。

2. 37℃水浴酶切 3-4h 。

3.配制 1.0%（ M/V）普通琼脂糖凝胶 30ml。

（1%（m/v）指：一般是固体溶于液体的， 1g 固体溶于 100mL水中。

）
4.适当放置冷却， 45℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。

5.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。

6.酶切样品中加入 5μl溴酚蓝 -GeneFinder 混合液混匀，上样。

7.1×TBE Buffer ， 80V（3-4V/cm）下电泳 30min。

8.荧光激发器观察质粒 DNA 条带的酶切情况，并照像。

4.2 回收酶切产物（采用天为时代 DNA回收试剂盒进行回收）
4.3 连接
1) 配30mL 1 ％进口琼脂糖凝胶，尽量长一些(用粗梳子)，对酶切产物进行电泳分离；
2) 将酶切产物全部加入加样孔中 3) 跑胶，观察结果，并且拍照。

4) 用干净的刀片将需要的 DNA 条带从凝胶上切下来，称取重量。

5) 以0.1g 凝胶对应 300μ L 的体积加入 PN(溶胶液) 。

6) 50℃水浴放置 10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。

7) 将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，
弃掉废液。

吸附柱，用于吸附层析)
8) 加入800μ L 漂洗液 PW ，13000rpm 离心 60s ，弃掉废液。

(PW 是去盐的洗脱液，目的是洗脱脂类、蛋白及盐类等杂质) 9) 加入500μ L 漂洗液 PW ，13000rpm 离心 60s ，弃掉废液。

10) 将离心吸附柱放回收集管， 13000rpm 离心 2min 。

11) 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液
EB 30μL ，洗脱缓冲液先在 65℃水浴预热，室温放置 2min ，13000rpm 离心 1min ，然后将离 心的溶液重新加回离心吸附柱中， 13000rpm 离心 1min 。

12) 置于－ 20 ℃保存。

按照连接体系进行， 16℃连接过夜。

13000rpm 离心 60s ，
反应物体积 / μL
回收纯化的 pET-28a 质粒
5
gfp 基因片段12
T4连接酶 1
缓冲液（ 10×） 2
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验目的
了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒 DNA 转化大肠杆菌细胞的原理和方法。

二、基本原理
外源 DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。

感受态指细菌细胞具有的能够接受外源 DNA 的一种特殊生理状态。

大肠杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在 0℃下加入到低渗的 CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。

这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5× 106-2× 107
个转化克隆子 /μg 超螺旋质粒 DNA 。

制备好的大肠杆菌感受态细胞可在 -70℃冻存。

在 0℃下外源 DNA 可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42 ℃， 90s）诱导细胞吸
收 DNA 。

（Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。

将该体系热激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。

进入细胞的外源DNA分
子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

）转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中 37℃培养1hr ，可使质粒DNA中编码
抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上
生长，而没有转化的细胞则无法生长。

三.实验材料、仪器 1. 实验材料
DH5α， BL21，pET-28a重组质粒 DNA
2. 使用仪器
水浴锅，高压灭菌锅、移液器、超净工作台、离心机、振荡培养箱，制冰机
四、操作步骤
1. LB （Luria-Bertain ）液体和固体培养基的配制（参考附录）
氨苄青霉素和卡那霉素等抗生素不抗热，如果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应
使培养基降温至 60℃左右后，再加入抗生素。

但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气
泡。

75mm 直径的培养皿约需 15ml 培养基。

2．感受态细胞的制备（CaCl 2法）
（1）挑一大肠杆菌单菌落放入 3ml LB液体培养基（含 Kan+）， 37℃培养过夜。

（2）活化大肠杆菌：取 3ml新鲜的 LB液体培养基加入 50-150 μ l 的过夜菌，培养2-3个小时。

（3）将昨夜摇出来的 DH5α 或BL21培养液转入离心管中 , 冰上放置 10min, 然后于4℃下
4000rpm离心 5min 。

（4）弃去上清 ,用预冷的 0.1mol/L 的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞 , 冰上放置20min, 4 ℃下 4000rpm离心 5min 。

（5）弃去上清 , 加入 300μ L预冷的 0.1mol/L 的CaCl2 溶液 , 轻轻悬浮细胞 , 冰上放置 5min, 即成感受态细胞悬液，可 -80 ℃长期保存。

3.转化涂板
（1）取2个无菌离心管，分别加入 100μL DH5α感受态细胞悬液，第 1管加5μl 无菌水，第 2管
加入质粒 DNA溶液 5μl, 轻轻摇匀 , 冰上放置 30min 。

（2）42℃水浴中热激 90s, 热激后迅速置于冰上冷却 5min。

（3）分别向管中加入 100μL LB液体培养基 ,混匀后在 37℃振荡培养 30min。

（4）从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上 , 从管2中取50μL和100μL涂布
于含抗生素的平板上。

正面向上放置约10分钟 , 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养
皿 ,37 ℃培养 20小时。

50μL 和100μL 构成浓度梯度，便于后续筛选菌落密度合适的平板）
实验六 重组质粒 DNA 的鉴定（双酶切法和菌落 PCR 法）
一、实验目的
掌握双酶切法鉴定重组质粒 DNA 的基本原理和操作步骤，以及菌落 PCR 法鉴定重组质粒 DNA 的基本原理。

了解菌落 PCR 法鉴定菌落及保存的操作方法。

二、基本原理
重组质粒 DNA 是利用限制性内切酶（如 BamH I 和 Not I ）分别酶切基因片段和质粒后， 利用基因片段和质粒 DNA 一端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利用相同的 限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组片段的大小与连接的基因 片段大小是否相同判断质粒 DNA 是否为重组质粒。

单菌落或提取的质粒 DNA 也可以通过 PCR 方法鉴定正确克隆。

聚合酶链式反应 （ Polymerase Chain Reaction ，简称 PCR ）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法。

典型的 PCR 由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使 目的 DNA 得以迅速扩增。

其主要步骤是：将待扩增的 DNA 置于高温下使之解链，人工合成的 两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与 DNA 两条链互补结合； DNA 聚合酶在 72℃ 将单核苷酸从引物的 3'端开始掺入，沿模板从 5'→ 3'方向延伸，合成 DNA 的新互补链。

具体地说， PCR 反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定 DNA 聚合酶
管1 50μL
管1 50μL 50μL 100μ L
管 2 管 2
（ Taq 酶），脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。

PCR 技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定
DNA 片的目的
段扩增 106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA 拷贝。

它
操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响。

因此，PCR 技术产生的时间虽不长，却以惊人的速
度广泛地应用于分子生物学的各个领域。

它可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。

三、实验材料、仪器及试剂
1. 实验材料
pET-28a 重组质粒 DNA 或菌落
2. 使用仪器
PCR 仪，掌中宝离心机，冰箱，小型混合器，电泳槽和电泳仪， 1.5ml 离心管，移液器及吸头，蓝盾可见光透射仪，恒温培养箱
3. 试剂
BamH I（10U/ μ L）（TaKaRa 公司）; Not I （10U/ μ L）（TaKaRa 公司）
四、实验步骤
1.双酶切法
（ 1）随机挑取 2个单菌落，接种， 37℃振荡培养过夜。

（2）质粒 DNA的提取（碱裂解法）。

（3）双酶切鉴定体系（10 μl）。