NMR实验技术

1600
1400
1200
1000
800
600
400
Hz
二、液体核磁共振谱分析对样品的要求
1、样品要求：
人们往往把注意力集中在谱仪操作上，而忽视样品准备。作为样品
提供者来说所关心的是得到一个信噪比好、分辩力高的谱图。所以， 花几分钟把样品准备好，可以节省几小时的谱仪的操作时间，同样， 处理好的纯样品可以得到可靠，准确的结构（分离手段的应用与纯 度非常重要）信息 。
一、NMR技术的起源与发展
二、液体NMR谱仪的基本结构和对样品
的要求
三、实验技术，方法,特点和选择
四、实验技术的新进展
一、NMR的起源与发展
1、原理的发现
核磁共振（NMR）现象是于1946年由美国斯坦福大学F. Bloch和哈佛大学的E. M. Purcell领导的两个研究小组分 别在水和石腊中观察到质子在静磁场里对射频（Radio Frequency,RF）辐射的共振吸收现象，即NMR现象。因此， 他们两人获得了1952年的诺贝尔物理学奖。自从1948年由 Bloch教授的几位学生参于制造NMR谱仪后，60多年来核磁 共振不仅形成为一门有完整理论的新兴学科——核磁共振 波谱学，并且各种新的实验技术不断发展，仪器不断完善， 在化学、生物、医学、药物等许多领域得到了广泛的应用。

3、样品管及样品用量:

作为一般常观实验，无论是高场谱仪还是一般谱仪对测试样品管 要求并不高（做大分子样品和微量样品除外），但样品管必需清洗干 净、无残留溶剂和杂质，以免影响测试结果。 虑样品的匀场和接收信号线形正常，另外，是送样量的要求，分了量 在300~500的样品，用样量5mg左右。测13C谱得加倍量。谱图的灵敏 度主要取决于样品的摩尔浓度。
1680 : 1
Signal/Noise ratio (for H
1
(Man-4'))
1130:1
594:1
800 MHz
600 MHz
400 MHz
不同场强谱峰分散度的比较
300 MHz 胆 固 醇
400 MHz
500 MHz
600 MHz
800 MHz
2800
2600
2400
2200
2000
1800
NMR发展的里程碑
Year 1970 1975 1980 Development FT NMR Superconducting magnets 2D NMR Nature Instrumental Instrumental Methodological
1985 1990
1990
Protein structure determination Isotope labeling/multidimensional NMR
高场仪器对样品溶剂的体积要求很严格，要保证一定的体积主要是考
4、样品的处理:

要得到高分辩的谱图，溶液中绝不能有悬浮的灰尘和纤维。一般 情况下用棉花和滤纸把样品直接过滤到样品管中。测试微量样品时， 要带手套处理样品，以防手指上的微量物质溶在溶液中，否则1H谱中 1.4ppm会出现一个7Hz裂分的双峰，4ppm还有一个四重峰，可能来自 丙氨酸或乳酸。
样品越纯越好(无杂质、水、溶剂和盐） 样品量：5～15mg 样品能很好地溶于某种常用的有机溶剂
常用氘代试剂：氯仿、丙酮、二甲基亚砜、甲醇、重水、吡啶
样品有足够的稳定性
在采集1D、2D谱过程中不应发生变化
2、溶剂选择

选择溶剂首先要考虑溶解性，要避免溶剂峰遮盖谱峰，一般氘代 试剂的氘化纯度在99.5%到99.99%，以上溶剂无论怎样纯总会出现一 些未氘化的残留峰和杂质峰，尤其是溶剂中的H2O峰常常大于残留峰， 如DMSO-d6，C5D5N等，要熟悉所用的氘待试剂可能出现的杂质峰对解 析谱图十分重要，见图（5）画出了常用氘化试剂的杂质峰。 溶解度对观察线宽影响很大，氢谱尤为突出，常用NMR溶剂分为 粘性（苯，二甲基酰胺、二甲基亚砜、吡啶、甲苯和水）和非粘性溶 剂（丙酮、乙晴、氯仿和二氯甲烷等）。丙酮常被用做测试分辩力和 线型的溶剂。常规NMR应用中，粘度问题不十分重要；含活泼氢溶剂 妨碍样品中活泼氢观察，在无活泼氢有机溶剂中观察活泼氢，再用 D2O交换确证；如用CDCL3检测1H，加D2O交换。高、低温实验要考虑 溶剂的溶点，沸点以及温度与溶解性的依赖关系。常用高温溶剂有 DMSO和DMF，常用低温溶剂是（CD3)2CO和CD2Cl2，含芳香环溶剂，如 苯和吡啶会引起化学位移观测值较大改变；最后一点，要考虑氘化试 剂的价格，尽量选便宜的溶剂，D2O和CDCL3最便宜，C5D5N、 CD3OD 和二氧六环最贵，从NMR观点，最受欢迎和常用的溶剂是CDCL3，DMSO 和D2O。
核磁共振实验技术
核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance）技术（方法）是从 原子水平研究物质结构的强有力手段，在生物、医学、药物、料、 环保、化工以及地矿等各个领域发挥着重大的作用。 到目前为止，NMR技术已是鉴别化合物结构最重要，也是最准 确的方法之一。 NMR技术也是唯一能够获取生物大分了溶液构象的方法。因此， NMR谱仪对基础科学和应用基础科学等重点领域中的重大研究项目 都具有极其重要的意义。 目前我国核磁谱仪有800多台，每年还以60-80多台的速度增长。 作为波谱解析课中的一个组成部分，前几节中已从NMR一般原理， 参数、新技术和应用及解析多方面进行了阐述和讲解，下面就以 NMR实验技术为主概括性的讲以下四部分：
3、NMR技术的应用
迄今为止，比较完善的NMR技术广泛的应用于化学、医学、生物学，药 理学，生物化学和药物学等领域，应用之广是很难全面概括的，正因为如此， 1991年诺贝尔化学奖授予了瑞士苏黎世联邦理工学院的NMR专家R. R. Ernst 教授，这不仅是对Ernst教授为核磁共振的发展作出杰出贡献的表彰，也是 对核磁共振在化学领域和其它学科发挥重要作用的肯定。很少有一项技术多 次获得诺贝尔奖，从该技术应用分类，主要有以下几类： a、医学和医学功能成像研究 在医院主要用于疾病的诊断（MRI）场强一般在100兆-200兆以内。近年 来，NMR成像的应用领域不断扩大，研究对象遍及人体，动物、植物、矿物 以及各种天然或人工合成材料，并逐渐形成了不同的分支学科，成像仪也逐 渐发展成适合于不同用途和不同研究对象的各类专用成像系统，如功能成像 所用场强最高的达到9个特斯拉(Ts)。 b、固体NMR研究 主要研究无机物、化工多聚物和高分子材料等方面的研究工作。 c、液体核磁的应用 研究分子结构和分子运动等现象，确定化合物结构。药物代谢产物和代 谢组学的研究。
Principles of a superconducting 观测道
锁信号接收器 探 头
锁通道
场调节装置
去偶道
Principles of an NMR spectrometer
不同场强仪器灵敏度的比较
Sensitivities Decasaccharid (zgpr, NS=64)
从NMR实验技术看经历了四个过程:
a、一维1H谱，连续波检测小分子结构。 b、脉冲付里叶变换实验，检测1H，13C和一些多核谱图，如31P， 15N等等（场强较高下完成）。 c、二维、三维和多维谱的发展 随着超导磁体的引入，计算机及电子技术的进一步发展，使得 二维和多维核磁共振技术在80年代末，90年代初发展很快，各种多脉 冲实验层出不穷，NMR技术变得更完善，更多样化和更具有针对性的 分析研究样品。 d、梯度场的发展 脉冲梯度场技术是90年代初用于NMR谱仪分析研究的，一经应 用于NMR分析，其优点很快的体现出来了，如利用梯度脉冲探头可以 在3分钟之内测试一个H-H COSY。大家知道匀场是做好NMR谱图的关键， 也是每个NMR操作者的基本功，以前为了匀场有时需要几十分钟或更 长时间，现在只需40多秒。
13C-谱 77 39.5 29.8 206 49 \
149.9;135.5;123.5
峰型 三重峰 七重峰 七重峰 七重峰
需加TSP-d4
128 53 1.3 118.2
三重峰 单峰 单峰 单峰
三、NMR实验技术与方法，特点，解决问题和 选择方法。
1、一维谱图
1)1H谱
1H-谱是结构测定中应用最普遍的方法。根据谱图可 提供：a、化学位移，b、偶合常数，c、积分值。从实验 上看也很简单只有一个90°脉冲，经FT变换后得谱图（图 6）。经过多年的集累分析，绝大多数类型的化合物都有 1H谱的化学位移，归属数据和有关图谱库可查阅。根据图 谱的数据，大致可以知道化合物的类型，分子结构的大小 纯度从而考虑进一步测试的项目。
Methodological Instrumental Instrumental
超导核磁共振谱仪磁体
2
2 5 3 3
1
1
4
6
4
7 8
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Ports for liquid N2 Ports for liquid He Superinsulation and high vacuum Main magnet coils + liquid helium Sample lift and spinner assembly NMR tube Shim assembly Probe-head
常用氘代溶剂化学位移值
溶剂
CDCL3 DMSO-d6 (CD3)2CO CD3OD D2O C5D5N C6D6 CD2CL2 CD3CN
1H谱 7.26 2.49 3.3 2.04 2.8 3.25 4.78 4.8
7.19;7.55;8.71
7.16 5.3 1.5 2.0
峰型 单峰 五重峰 五重峰 五重峰 单峰 三重峰 单峰 单峰 单峰
2、谱仪发展过程
从最初的NMR谱仪，经历了三次大的革命，由不同类 型的NMR波谱仪，可按不同的方式进行分类。例如：
a.按激发和接收方式可分为：连续波发射，分时发射和脉 冲发射谱仪；
b.按磁体的性质分为：永磁、电磁和超导磁体谱仪。
连续波永磁谱仪结构简单，易于操作，但由于灵敏度 太低，80年代已淘汰了。70年代初发展了电磁体NMR谱仪 使磁场强度一直加大，高时可达100兆，磁体重2.7吨，而 且耗电量也很大。随着超导技术、电子技术和计算机技术 的发展，脉冲付里叶变换高分辩超导NMR仪在近二十年来 发展很快。场强由88年的600兆，94年的750兆，98年的 800兆至2000年10月900兆。现在已有1000兆高场谱仪上市。
核磁共振与诺贝尔奖
连续波（CW－NMR）发展时期（50年代到60年代中期）：1H、13C、 19F和31P谱的应用。 脉冲傅立叶变换核磁共振（PFT-NMR）：1965到70年代，瑞士科 学家R.Ernst引入并发1946年发现核磁共振现象。F. Purcell和E. M. Bloch分享1952年诺贝尔物理学奖。 展了脉冲傅立叶变换核磁共振。从 CW － NMR 到 PFT － NMR 是 NMR 技 术的一次质飞跃。 二 维 核 磁 共 振 ： 1971 年 ， Jeener 首 次 提 出 二 维 核 磁 共 振 ； 1975～1976年间R.Ernst从理论和实践两方面对2D NMR进行了深入 的研究，R.Ernst获1991 年诺贝尔化学奖。 90 年代，三维、四维 NMR ；高场（ 600 ～ 900 兆）谱仪的出现及 梯度场技术的发展。 生 物 大 分 子 的 溶 液 结 构 测 定 ： 2002 年 10 月 瑞 士 科 学 家 库 尔 特·维特里希（Wüthrich K.）因发明了利用核磁共振技术测定溶 液中生物大分子三维结构的方法而获得诺贝尔化学奖。 核 磁 共 振 成 像 ： 2003 年 10 月 , 美 国 科 学 家 劳 特 布 尔 (Paul C. Lauterbur)和英国科学家曼斯菲尔德(Peter Mansfield)因在核磁 共振成像技术领域的“突破性成就” 而获得诺贝尔生理学或医学
Pulsed field gradients
Methodological Methodological
Instrumental/ Methodological
1995
1997 1998 2000
NMR screening
TROSY LC-NMR/LCMS-NMR Cryoprobes
Methodological