Gateway实验方案

Gateway实验方案
TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆
∙步骤一–制备PCR 产物
使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。

通过
最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。

步骤二- 进行TOPO® 克隆反应
1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆
反应。

对于电穿孔，将盐溶液稀释4 倍以制备稀释
盐溶液。

试剂化学转染电穿孔法
新鲜的PCR 产物0.5 至4 µl 0.5 至4 µl
盐溶液 1 µl --
稀释盐溶液-- 1 µl
无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µl
TOPO® 载体 1 µl 1 µl
总体积 6 µl 6 µl
2. 轻轻混合并在室温下孵育5 分钟。

3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态E. coli，步骤如下
步骤三- 转化One Shot® 化学感受态 E. coli
1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。

2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入2 µl TOPO® 克隆反应液，
轻轻混匀。

3. 在冰上孵育5 至30 分钟。

4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。

立即
将试管转移至冰上。

5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。

6. 在37°C 下振荡孵育1 小时。

7. 在预热的LB 琼脂平板上涂布10-50 µl 细菌培养物（琼脂平板含有
100 µg/ml 大观霉素），并于37°C 下过夜孵育。

Gateway® 反应的基础知识
∙BP 反应
从含有att B 侧翼序列的PCR 产物到生成Gateway® 入门克隆只需 1 小时的简单反应。

参见下文的实验设置概述。

更多详细信息，请参阅说明书。

1. 在室温下向1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：
attB-PCR 产物（=10 ng/µl；最终量~15-150 ng）1-7 µl
供体载体(150 ng/µl) 1 µl
TE 缓冲液，pH 8.0 补充至8 µl
2. 将BP Clonase™II 酶混合物置于冰上约2 分钟解冻。

对BP Clonase™II 酶混合物
稍微震荡两次（每次 2 秒）。

3. 对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入2 µl BP Clonase™II 酶混合物，稍微震
荡两次以充分混匀。

进行短暂的低速离心。

4. 将BP Clonase™II 酶混合物放回-20°C 或-80°C 储存。

5. 反应体系25°C 孵育1 小时。

6. 向每份样品中加入1 µl 蛋白酶K 溶液来终止反应。

稍微震荡。

在37°C 下孵育样
品10 分钟。

转化
7. 取1 µl 的各LR 反应液转化50 µl One Shot® OmniMAX ™2 T1 噬菌体抗性细胞（目
录号C8540-03). 冰上孵育30 分钟。

通过30 秒的42°C 孵育对细胞进行热休克。

加入250 µl S.O.C. 培养基并在37°C 震荡孵育1 小时。

将20 µl 和100 µl 每种
转化液分别涂布于选择性平板上。

注意：任何转化率达>1.0 ×10 8 转化子/µg 的
感受态细胞均可以使用。

8. 取1 µl pUC19 DNA (10 ng/ml) 转化50 µl 上述One Shot ® OmniMAX™2 T1 噬菌体
抗性细胞。

在含100 µg/ml 卡那霉素或含供体载体的相应选择性标记物的LB 平板上
涂布20 µl 和100 µl。

∙
预期结果
如果转化并涂布全部BP 反应液，则高效的BP 重组反应将产生1500 个以上的菌落。

∙LR 反应
将基因从Gateway® 入门克隆转移至目的载体只需 1 小时的简单反应。

参见下文的实验设置概述。

更多详细信息，请参阅说明书。

1. 在室温下向1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：
入门克隆(50-150 ng) 1-7 µl
目的载体(150 ng/µl) 1 µl
TE 缓冲液，pH 8.0 补充至8 µl
2. 将LR Clonase™II 酶混合物置于冰上约2 分钟解冻。

对LR Clonase™II 酶混合物进
行两次短暂的漩涡震荡（每次 2 秒）。

3. 对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入2 µl LR Clonase ™II 酶混合物，并通过
两次短暂的漩涡震荡将其混合均匀。

进行短暂的低速离心。

4. 将LR Clonase™II 酶混合物放回至-20°C 或-80°C 储存。

5. 反应体系25°C 孵育1 小时。

6. 向每份样品中加入1 µl 蛋白酶K 溶液来终止反应。

稍微震荡。

在37°C 下孵育样
品10 分钟。

转化
按照BP 的对应方案操作，不同的是需要在适合目的载体的LB 平板上使用选择性标志物（通常是100 µg/ml 氨苄青霉素）。

预期结果
如果转化并涂布全部LR 反应液，则高效的LR 重组反应将产生5000 以上个菌落。

单管形式
如果希望将两侧具有attB 位点的PCR 产物直接转移到表达克隆中，可以使用以下方案轻松的将BP 和LR 反应结合在一起。

这样就避免了构建Gateway® 入门克隆时的转化和DNA 提取过程。

1. 在一个1.5 ml 的微型离心管中，准备如下的15 µl BP 反应体系：
attB DNA (50-100 ng) 1.0-5.0 µl
attP DNA（pDONR™载体，150 ng/µl）1.3 µl
BP Clonase™II 酶混合物3.0 µl
TE 缓冲液，pH 8.0，最终体积为15 µl
2. 在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C 孵育4 小时。

注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达20 小时。

与仅孵育 1 小时相比，过夜孵育通常可多产生 5 倍的菌落。

对于较大的质粒(=10 kb) 和较长的PCR 产物(=5 kb)，推荐采用较长的孵育时间。

3. 从反应体系中取出5 µl 移到另一管中，用以评估BP 反应的效率（见下文）。

4. 向余下的10 µl 反应体系中加入：
目标载体(150 ng/µl) 2.0 µl
LR Clonase™II 酶混合物3.0 µl
最终体积为15 µl
5. 在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C 孵育2 小时。

注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达18 小时。

6. 加入2 µl 蛋白酶K 溶液。

于37°C 孵育10 分钟。

7. 用1 µl 反应产物转化50 µl 相应的感受态E. coli。

8. 然后涂板于含相应抗生素的LB 平板，以便筛选表达克隆。

评估BP 反应的效率
1. 向由上述“单管”方案的步骤3 得到的5 µl 反应产物中加入0.5 µl 蛋白酶K 溶液。

于37
°C 孵育10 分钟。

∙用1 µl 反应产物转化50 µl 相应的感受态E. coli。

涂板于含相应抗生素的LB 平板，以便筛选入门克隆。

∙Gateway® 载体转化(Gateway® Vector Conversion)
将最爱使用的克隆载体组转化为Gateway® 载体是一种相当直观的方案，这种转化最终能简化克隆和表达过程。

如要将克隆载体转化为Gateway® 目的载体，需要：
1. 根据需要选择合适的阅读框盒。

2. 利用选择的限制性内切酶，使要转化的载体线性化。

0如果使用的限制性内切酶会产生
突出末端，则需要把末端补平。

3. 使用小牛肠碱性磷酸酶去除载体中的5' 磷酸。

4. 使用T4 DNA 连接酶将阅读框盒连接入载体中。

5. 用连接反应物转化One Shot® ccdB Survival™感受态E. coli，并筛选转化子。

6.分析转化子。