王瑶-真菌药敏试验操作ppt课件
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0.5×104~5×104 CFU/ml
皮肤霉菌 •PDA；燕麦琼脂（仅红色毛癣菌 )
•30℃4~5d至产孢良好 1×103~3×103 CFU/ml
接种量
孵育条件
•链格孢属30℃；
•其它35℃。 •根霉21~26h； •镰刀菌属、曲霉属、申克氏孢 子丝菌46~50h •赛多孢属70~74h
35℃
培养至产孢良好
11
非皮肤丝状真菌孢子菌悬液的制备
• 接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×104~5×104 CFU/ml，重复性好
– 诱导产孢：大部分霉菌PDA培养基35±2⁰C 7d或至产孢良好，毛霉 和曲霉48h，镰刀菌属35±2⁰C 48~72h然后28~30±2⁰C培养到第7天 。 – 1ml 0.85%盐水，可加入1滴or0.01ml吐温20，尽量去除菌丝片段。 – 静置3~5min，取上清转移至无菌管，振荡15s（注意气溶胶） – 使用光线路径1cm比色杯，测定530nm光密度：
13
CLSI M38-A2棘白菌素类MEC判读
• 最低有效浓度（MEC）：棘白菌素-曲霉
– 与不含药物的生长对照相比，能够导致菌丝形 成小的、圆形的、紧凑的菌丝颗粒的最低药物 浓度
MEC
异常的14Fra bibliotek卡泊芬净MEC判读
黑曲霉
黄曲霉 土曲霉
烟曲霉
生长对照
15
浓度梯度稀释法--ETEST
酵母菌Etest药敏试验方法
• 曲霉、拟青霉0.09~0.13， • 镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢0.15~0.17， • 链格孢、离蠕孢0.25~~0.3
– 悬液1:50稀释，达到最终要求浓度的2倍
CLSI M38-A2丝状真菌肉汤稀释法
丝状真菌M38-A2
判读标准 非皮肤霉菌 •两性霉素B：100% 和时间 皮肤霉菌 •两性霉素B：100%
5
CLSI M27-A3酵母菌24h与48h读取区别 • 大部分酵母菌MIC在24h和48h区别很小 • 部分菌株，24h MIC结果与临床相关性更好
– 氟康唑：约5%菌株在48h产生严重拖尾现象， 使24h敏感株在48h变为耐药，动物实验表明这 些菌株体内敏感。 – 棘白菌素类折点按24h结果制订
酵母菌Etest操作视频.mov
判读方法
ATB Fungus 3判读规则
• 与生长对照相比
– – – – – 生长不减少＝4分 生长稍减少＝3分 生长明显减少＝2分 很微弱生长或管壁周围生长=1分 不生长＝0分
• 唑类药敏易出现拖尾，机读易产生假耐药结果， 应进行人工较正 • ATB Fungus 3结果展示.mov
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商品化试剂盒- YeastOne 色原度物法MIC判读
侵袭性真菌药敏试验操作标准
王 瑶 北京协和医院 检验科 2015年3月8 日
真菌药敏试验指南
CLSI
• M27-A3酵母菌肉汤稀释法
– M27-S4 QC & BPs
EUCAST
• E.DEF 7.2 酵母菌肉汤稀释 法 • E.DEF 9.1 产孢丝状真菌肉 汤稀释法 • 真菌临床折点V6.1
• M38-A2丝状真菌肉汤稀释 法 • M44-A2酵母菌纸片扩散法
• CLSI 提供了24h和48h质控范围
6
商品化试剂盒—ATB Fungus 3 改良微量肉汤稀释法
• 选取培养时间不超过4天的纯培养菌落，如培养物不纯应 进行分纯后检测 • 制备2McF菌液 • 将20μl菌悬液加入ATB F2培养基的安瓿中 • 用无菌吸管轻轻吹吸混均，尽量避免产生气泡 • 在每个杯状凹槽中加入135μl混匀的ATB F2培养基 • 35± 2℃环境中，念珠菌属培养24h ±2h，新型隐球菌培 养48 h ± 6 h • ATB Fungus 3操作视频.mov
•氟康唑、氟胞嘧啶、酮康 唑：50%抑制 •伊曲康唑、泊沙康唑、雷 伏康唑、伏立康唑：100% 抑制 •棘白菌素类：MEC – 曲霉、宛氏拟青霉： 21~26h – 赛多孢菌属：46~72h – 或至产孢良好第一天
•氟康唑、氟胞嘧啶、酮康唑： 80%抑制 •伊曲康唑、泊沙康唑、雷伏康 唑、伏立康唑：80%抑制 •环吡酮胺：80%抑制 •灰黄霉素：80%抑制 •特比萘芬：80%抑制
培养基 接种量 孵育条件 RPMI1640+2%葡萄糖+3.45%MOPS+1.5% Bacto琼脂 ，pH 7.0±0.1 念珠菌：0.5 McFarland 新型隐球菌：1 McFarland 念珠菌：35℃，24~48h 新生隐球菌： 35℃，48~72h 两性霉素B：100%抑制 氟胞嘧啶：90%抑制 唑类：80%抑制 卡泊 芬净：80%抑制
POS
• 加入Alamar蓝 • 蓝色（阴性） • 红色（阳性）
两性霉素B
其它药物
9
微量肉汤稀释法—丝状真菌
丝状真菌肉汤稀释法CLSI M38-A2
培养基 RPMI 1640, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0±0.1
菌株传代
非皮肤霉菌 •PDA 35℃ •结合菌、曲霉48h； •镰刀菌35℃48~72h,然后在 25~28 ℃培养至7d
4
CLSI M27-A3酵母菌 微量肉汤稀释法判读时间和标准
• 两性霉素B：24或48h，100%抑制 • 氟康唑、伏立康唑(M27-S4)： 24h，50%抑制；如 生长对照生长不充分，则48h判读 • 伊曲康唑、雷伏康唑、泊沙康唑：48h，50%抑制 • 5-氟胞嘧啶：48h，50%抑制 • 棘白菌素类：24h，50%抑制 • 不能24h读取结果的药物，是由于其折点按照48h 结果制订，或其24hMIC结果没有完成临床应用评 估
– M44-S3 QC & BPs
• M51-A丝状真菌纸片扩散 法
– M51-S1 QC & ECVs
2
微量肉汤稀释法--酵母菌
酵母菌肉汤稀释法CLSI M27-A3
• 培养基：RPMI 1640, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0±0.1 • 菌株传代：沙保弱培养基(SDA)或土豆培养基 (PDA)，35℃，念珠菌24h，隐球菌48h • 接种量：5.0×102~2.5×103CFU/ml • 孵育条件：35℃，非新型隐球菌24~48h；新型隐 球菌70~74h
皮肤霉菌 •PDA；燕麦琼脂（仅红色毛癣菌 )
•30℃4~5d至产孢良好 1×103~3×103 CFU/ml
接种量
孵育条件
•链格孢属30℃；
•其它35℃。 •根霉21~26h； •镰刀菌属、曲霉属、申克氏孢 子丝菌46~50h •赛多孢属70~74h
35℃
培养至产孢良好
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非皮肤丝状真菌孢子菌悬液的制备
• 接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×104~5×104 CFU/ml，重复性好
– 诱导产孢：大部分霉菌PDA培养基35±2⁰C 7d或至产孢良好，毛霉 和曲霉48h，镰刀菌属35±2⁰C 48~72h然后28~30±2⁰C培养到第7天 。 – 1ml 0.85%盐水，可加入1滴or0.01ml吐温20，尽量去除菌丝片段。 – 静置3~5min，取上清转移至无菌管，振荡15s（注意气溶胶） – 使用光线路径1cm比色杯，测定530nm光密度：
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CLSI M38-A2棘白菌素类MEC判读
• 最低有效浓度（MEC）：棘白菌素-曲霉
– 与不含药物的生长对照相比，能够导致菌丝形 成小的、圆形的、紧凑的菌丝颗粒的最低药物 浓度
MEC
异常的14Fra bibliotek卡泊芬净MEC判读
黑曲霉
黄曲霉 土曲霉
烟曲霉
生长对照
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浓度梯度稀释法--ETEST
酵母菌Etest药敏试验方法
• 曲霉、拟青霉0.09~0.13， • 镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢0.15~0.17， • 链格孢、离蠕孢0.25~~0.3
– 悬液1:50稀释，达到最终要求浓度的2倍
CLSI M38-A2丝状真菌肉汤稀释法
丝状真菌M38-A2
判读标准 非皮肤霉菌 •两性霉素B：100% 和时间 皮肤霉菌 •两性霉素B：100%
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CLSI M27-A3酵母菌24h与48h读取区别 • 大部分酵母菌MIC在24h和48h区别很小 • 部分菌株，24h MIC结果与临床相关性更好
– 氟康唑：约5%菌株在48h产生严重拖尾现象， 使24h敏感株在48h变为耐药，动物实验表明这 些菌株体内敏感。 – 棘白菌素类折点按24h结果制订
酵母菌Etest操作视频.mov
判读方法
ATB Fungus 3判读规则
• 与生长对照相比
– – – – – 生长不减少＝4分 生长稍减少＝3分 生长明显减少＝2分 很微弱生长或管壁周围生长=1分 不生长＝0分
• 唑类药敏易出现拖尾，机读易产生假耐药结果， 应进行人工较正 • ATB Fungus 3结果展示.mov
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商品化试剂盒- YeastOne 色原度物法MIC判读
侵袭性真菌药敏试验操作标准
王 瑶 北京协和医院 检验科 2015年3月8 日
真菌药敏试验指南
CLSI
• M27-A3酵母菌肉汤稀释法
– M27-S4 QC & BPs
EUCAST
• E.DEF 7.2 酵母菌肉汤稀释 法 • E.DEF 9.1 产孢丝状真菌肉 汤稀释法 • 真菌临床折点V6.1
• M38-A2丝状真菌肉汤稀释 法 • M44-A2酵母菌纸片扩散法
• CLSI 提供了24h和48h质控范围
6
商品化试剂盒—ATB Fungus 3 改良微量肉汤稀释法
• 选取培养时间不超过4天的纯培养菌落，如培养物不纯应 进行分纯后检测 • 制备2McF菌液 • 将20μl菌悬液加入ATB F2培养基的安瓿中 • 用无菌吸管轻轻吹吸混均，尽量避免产生气泡 • 在每个杯状凹槽中加入135μl混匀的ATB F2培养基 • 35± 2℃环境中，念珠菌属培养24h ±2h，新型隐球菌培 养48 h ± 6 h • ATB Fungus 3操作视频.mov
•氟康唑、氟胞嘧啶、酮康 唑：50%抑制 •伊曲康唑、泊沙康唑、雷 伏康唑、伏立康唑：100% 抑制 •棘白菌素类：MEC – 曲霉、宛氏拟青霉： 21~26h – 赛多孢菌属：46~72h – 或至产孢良好第一天
•氟康唑、氟胞嘧啶、酮康唑： 80%抑制 •伊曲康唑、泊沙康唑、雷伏康 唑、伏立康唑：80%抑制 •环吡酮胺：80%抑制 •灰黄霉素：80%抑制 •特比萘芬：80%抑制
培养基 接种量 孵育条件 RPMI1640+2%葡萄糖+3.45%MOPS+1.5% Bacto琼脂 ，pH 7.0±0.1 念珠菌：0.5 McFarland 新型隐球菌：1 McFarland 念珠菌：35℃，24~48h 新生隐球菌： 35℃，48~72h 两性霉素B：100%抑制 氟胞嘧啶：90%抑制 唑类：80%抑制 卡泊 芬净：80%抑制
POS
• 加入Alamar蓝 • 蓝色（阴性） • 红色（阳性）
两性霉素B
其它药物
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微量肉汤稀释法—丝状真菌
丝状真菌肉汤稀释法CLSI M38-A2
培养基 RPMI 1640, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0±0.1
菌株传代
非皮肤霉菌 •PDA 35℃ •结合菌、曲霉48h； •镰刀菌35℃48~72h,然后在 25~28 ℃培养至7d
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CLSI M27-A3酵母菌 微量肉汤稀释法判读时间和标准
• 两性霉素B：24或48h，100%抑制 • 氟康唑、伏立康唑(M27-S4)： 24h，50%抑制；如 生长对照生长不充分，则48h判读 • 伊曲康唑、雷伏康唑、泊沙康唑：48h，50%抑制 • 5-氟胞嘧啶：48h，50%抑制 • 棘白菌素类：24h，50%抑制 • 不能24h读取结果的药物，是由于其折点按照48h 结果制订，或其24hMIC结果没有完成临床应用评 估
– M44-S3 QC & BPs
• M51-A丝状真菌纸片扩散 法
– M51-S1 QC & ECVs
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微量肉汤稀释法--酵母菌
酵母菌肉汤稀释法CLSI M27-A3
• 培养基：RPMI 1640, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0±0.1 • 菌株传代：沙保弱培养基(SDA)或土豆培养基 (PDA)，35℃，念珠菌24h，隐球菌48h • 接种量：5.0×102~2.5×103CFU/ml • 孵育条件：35℃，非新型隐球菌24~48h；新型隐 球菌70~74h