8-1药物的抗菌试验

纸片含药量 （ug）
丁胺卡那霉素
30
Байду номын сангаас
头孢唑啉
30
先锋霉素I
75
头孢噻吩
30
头孢噻甲羧肟
30
氯霉素
30
红霉素
15
庆大霉素
10
抑菌环直径（mm）
耐药 中度敏感 敏感
≤4
15-16
≥7
≤14
15-17
≥18
≤ 15
≥21
≤14
15-17
≥18
≤14
15-17
≥18
≤12
13-17
≥18
≤13
13-15
≥18
固体培养基连续稀释法，又可分为平板法和斜面法。
4
2. 2.琼脂扩散法 利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌 生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验。
1. 滤纸片法（纸碟法）
滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步 药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三 性试验、以便选择用药）。滤纸片分湿、干两种，可以在 试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也 以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干 燥纸片实用一些而且准确一些。
≤12
13-14
≥15
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第2节 灭菌制剂的无菌检查法
❖ 无菌检查的基本原则
1. 严格进行无菌操作 2. 正确进行样品采集
❖ 无菌检查用培养基
1
第1节 药物的抗菌试验
药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或 杀菌药物的抑菌试验；测定药物杀菌活性的杀菌试验； 以及检查两种药物联合作用的联合抗菌试验等。一般 抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑 菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药 物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能 生长。
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的 大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还 是耐药。
6
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条 件下根据抑菌圈大小来判断，比如：
抗生素或化疗药物 耐药
抑菌圈直径（mm） 中敏 敏感
氯霉素 红霉素 四环素 卡那霉素
≤12 ≤13 ≤14 ≤13
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复习题： 1. 药物体外抑菌试验常用的方法有哪几种？具体的试验 操作方法？ 2. 如何测定药物的最小致死浓度？ 3. 联合抗菌试验常用的方法有哪些？ 4. 药物体内抗菌试验的方法？ 5. 抗菌试验的影响因素有哪些？
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实验 细菌对药物敏感性的实验 （药敏片扩散法）
目的意义： 掌握药敏片扩散法进行药敏实验的一般方法 体会药敏实验在临床用药上的指导意义
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三、影响抗菌试验的因素
1. 菌种 在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国家
卫生部生物制品检定所菌各保藏中心专门提供 的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临床 新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌株。 而且我们要用到的试验菌种应该选择是对数期 生长的菌。因为那时菌种生命力最旺盛，这对 于我试验测定的结果也会准确些。
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药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对 而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时 培养基的组成、温度、PH值及所用的菌种、菌量 等各个因素有关。 虽然说体外抗菌试验有很多优点，但是由于体外 抗菌试验没有复杂的体内因素影响，因此药物体 外抗菌试验和体内抗菌试验可能会出现不一致的 结果。所以，一般我们在体外对药物进行测试后， 有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次 证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。
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（三）、 联合抗菌试验 联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药物联合 应用时的相互影响。两种抗菌药联合应用时抗 菌作用加强的称为协同作用；抗菌作用减弱的 称为拮抗作用；相互无影响的称为无关。常用 的联合抗菌试验的方法有以下几种。
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联合药物敏感试验和杀菌试验
意义
目的在于：①治疗混合性感染； ②预防或推迟细菌抗生素耐 药性的发生； ③联合用药可以减少剂量以 避免达到毒性剂量； ④联合用药比单一用药时效 果更好。
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药物及浓度
链霉素 （µg／ml）
64 32 16 8 4
青霉素G单药对照
青霉素G(IU／m1) 4 2 1 0.5 0.25
-- -- -- -- -- -- -
---++ ++ ++
链霉素单药对照
+ + 细菌对照
-：无细菌生长 +：有细菌生长 FIC指数=1／1+16／16=2——无关
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2.纸条试验 在含菌平板上垂直放两条浸有不同药液的滤纸 条，培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判 断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作 用。
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FIC指数 0 ． 5为协同作用；0．5－1为相加 作用； 1～2为无关作用；＞2为拮抗 作用。
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[棋盘法的设计] 棋盘法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都 有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精 确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相 互作用。 在进行棋盘法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试 菌的MIC，然后以两药MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以 及MIC的1/2、1/4、1/8浓度（或4倍、2倍、1倍、1/2、 1/4浓度）分别进行联合。可见举例，如表—1的青霉 素G与链霉素联合药敏实验和表2的TMP+SMZ的联合 作用。
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实验步骤:
1、用无菌棉拭子沾取小量待测菌液，均匀涂布 平板，待稍干后， 用无菌眼科镊将各种药敏 片分别平贴在平板培养基表面，每板4-6个， 相互间应有一定距离（15mm）。
2、置37℃ ，培养8-12h，观察结果。 3、结果判定：观察有无抑菌圈
及测量其直径，按下表判定 对药物的敏感性。
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抗菌药物
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1. 酚系数测定（石炭酸系数测定） 酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂与杀菌效力 相比较，所得的就是杀菌效力的比值。 由于各种化学消毒剂杀菌原理各不相同，因而这种方法 仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。 具体的测定方法说是分别将酚及待测化学消毒剂按不同 比例稀释，各取5ml放到试管中，再加入经24小时培养 后的菌悬液各0.5ml，混匀后放入 20℃水浴中，5、10、 15分钟分别取一接种环混合液移种到另一支5 ml的肉 汤培养基中，37℃培养24小时记录生长情况。
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出现4种结果： ①无关作用小，两种药物联合作用的活性
等于其单独活性； ②桔抗作用，两种药物联合作用显著低于
单独抗菌活性； ③累加作用，两种药物联合作用时的活性
等于两种单独抗菌活性之和； ④协同作用，两种药物联合作用显著大于
其单独作用的总和。
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1. 棋盘格法
棋盘稀释法是常用的定量方法，首先 分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌 的MIC。药物最高浓度为MIC的2倍，对 倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的 纵列和横列进行，这样在每管（孔）中 可得到不同浓度组合的两种药物混合液。 接种菌量为5×105CUF／ml，35℃孵育 18h后观察结果。计算部分抑菌浓度 （FIC）指数。
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1. 抗菌药物 药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试 验的结果，必需精确配制。如果是固体药物，必需使药物 溶解或使药物呈均匀悬液。PH值应调至中性，以确保药物 的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为有颜色和含有 鞣质，结果的判断，应特别注意。 2. 对照试验 为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各 种对照试验。 试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。 溶剂及稀释液对照：配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液 均应无抗菌作用。 已知药物对照：应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效 应。
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至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的 滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌 2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每 100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿 中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。如 果是β－内酰胺类抗生素还要放在-20℃保存。这就制成了 干燥的含药液的纸片。
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1. 活菌计数法 将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中，作用 一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微生物 数量计算出药物对试验菌的致死率，从而判断药物的 杀菌能力。 活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合液 稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板上 形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来 的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中 存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与试 验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后 数菌落数。
基本原理：
药敏片是含有抗生素的滤纸片，将其置于涂满待 测菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内扩 散，抑制细菌生长，从而出现抑菌环。根据抑菌环 的大小可以判定细胞对此药物的敏感度。
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器材及试剂: 药敏片：含各种抗生素的市售产品 培养基平板：普通牛肉膏蛋白胨固体培养基，待 检细菌的培养物。 眼科镊、无菌棉拭子、酒精灯等。
13-17 14-17 15-18 14-17
≥18 ≥18 ≥19 ≥18
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1. 打洞法
在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔，4个小孔加不同浓 度标准溶液，另外2个小孔加血清样品，放在37℃，1218小时，测定其抑菌圈直径。所以说微量法适于药物血浓 度的监测。优点是微量（血清用量少）敏感，操作简便。 除此之外还有管碟法、直接滴加法和挖沟法：适用于测试 一种药物对几种细菌的抗菌作用。方法是先制备普通琼脂 平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种 细菌。经过培养以后观察家细菌生长的情况。我们可以根 据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细 菌的抗菌能力。
第8章 药物制剂的微生物学检查
1.掌握药物的体外试菌试验方法（琼脂扩散法和系列稀释法）， 了解药物的体内抗菌实验。 2.掌握一般灭菌制剂的无菌检查方法和原理，熟悉特殊药品的 无菌检查法。 3.掌握非灭菌药物的微生物总数测定方法，熟悉药品的大肠杆菌 检查方法。 4.了解一般药品的沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破 伤风杆菌的检查方法。
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第一节 药物的体外抑菌试验
一、药物的体外抑菌试验 （一）体外抑菌试验 药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用 的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法 稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法） 两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度 （MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通 常用μg∕ml或U/ml表示。 具体的液体培养基连续稀释法见书本（P138图8-1），
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3. 纸条梯度平板试验 将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜
面培养基。将平皿放平加入含抗菌药物的琼脂培养 基，这样在制成的双层琼脂平板中含有梯度浓度的 抗菌药物。要求其最小抑菌浓度的位置约处于平板 的一半。然后将试验菌液均匀涂布在平板表面。取 纸条浸透另一待检药液，按梯度中药物浓度递减的 方向置于平板表面，培养后观察形成的抑菌区的图 形以判断两种药物之间的相互作用。
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二、药物的体内抗菌试验
药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保护 力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体 内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质或磷脂、 脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组 织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物， 代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可形成细 胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中 药物的吸收，分布不同，使药物的浓度难以恒定。因此 在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内 的抗菌试验。
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一）、 体外杀菌试验 杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。 1. 最低杀菌浓度（MBC）（最小致死浓度MLC） 的测定 按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的MIC。 然后把未长出菌的各个试管培养液分别移种到无 菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最 低浓度就是最小致死浓度（MLC）。如果是细菌 的话可以称为最小杀菌浓度（MBC）。
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1. 培养基 试验所有到的培养基应按各试验菌的营养要求 进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及 培养基的配制过程。要注意当有些药物具有抗 代谢作用时，培养 应不能存在代谢物，否则 抑菌作用将会被消除。培养基内如果含有血清 等蛋白质时，有可能与某些抗菌药物结合，使 抗菌药物失去，所以就要避免培养基混进这类 营养物。