酪氨酸酶的提取及其催化活性研究

实验：酪氨酸酶的提取及其催化活性研究

一、前言：生物酶的基本知识

酶（enzyme）是由生物细胞合成的、对特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。生物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点：

1、酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构，以提供

反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而

失活，所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的，如人体中的各种酶促反

应，一般都为37℃）和pH约为7的条件下进行。

2、酶促反应所需的活化能较低。如使1mol蔗糖水解所需活化能高达1.34MJ，用

H+离子作催化剂时活化能降至87.9 KJ，若用蔗糖酶催化时只需39.4 KJ。

3、酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反应高108 ~1020倍，比一

般非生物催化剂高107~1013倍。如存在于血液中能催化H2CO3分子分解的碳

酸酐酶，它的催化效率非常高，每一分子每分钟可以催化数万个H2CO3分子分

解。正是因为血液中有这样高效率的酶，才能及时完成排放CO2的任务，维

持血液的正常生理pH值。

4、酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性，每一种酶只能对某

一类物质甚至只对某一种物质起催化作用，这是一般非生物陈化剂所无法比拟

的。

影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度和抑制剂等。在酶浓度恒定的情况下，增加底物的浓度，可以提高酶促反应的初速度。当底物浓度增至某一限度后，反应初速度就不再随底物的浓度而变化，而是逐渐趋近某一极限值，这个极限值称为最大速度(V max)。

酶的以上特性已引起化学工作者的极大兴趣，例如酶正被作为分析试剂、探针得到应用；生物酶的化学模拟已广泛开展，将为研制高性能的工业催化剂奠定基础。酶的电化学研究的开展还开辟了生物电化学的新领域。酶化学是一门交叉学科，对其研究具有广阔的前景。酶促反应动力学是酶化学的主要内容之一，这方面的研究具有重要的理论和实践意义。

二、实验目的

1、认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中酶促反应的特点与有机合成的不同

和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性。

2、掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析的手段研究催化反应，特别是

生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。

三、实验原理

酪氨酸是一种以Cu + 或Cu 2+

为辅助因子的全酶，能催化空气中的氧对多巴的氧化反应。催化过程可以通过多巴转换反应过程的颜色变化来监测，通过测定吸光度随时间的变化来求的酶的活性。

酪氨酸酶可用比色法测定。由于多巴转变成多巴红速率很快，在转到下一步产率慢得多，故可在酶存在下，测定多巴转变为多巴红的速率而测定酶的活性。（可用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性）。

酶参与的多巴转换反应如下：

酪氨酸——多巴——多巴醌——无色——多巴红——二羟基吲哚——吲哚醌——黑色素

酶的活性计算： 一般pH 、离子强度），25℃时在 1min 内转化1 mol 底物所需要的量为酶的活性单位。通过下式可计算出所用的酶的活性：6

10kt a ⨯∆=

V

A ，式中：a 为所用溶液的酶的活性，A ∆

为最大吸收处吸光度的变化，t 为时间，k 为酪氨酸的摩尔吸收系数，V 为加入的酶体积。

进而计算出所用原料中的酶的活性： m

a a 0V =

'，式中：a '为原料中酶的活性，0V 为

原料所得的酶溶液的总体积，m 为原料总质量。

本实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并测定其活性，使我们对酶有个基本认识。当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时，在空气作用下，很快变为棕色，这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。

四、仪器和试剂

1、仪器：分光光度计、离心机、电子天平、研钵、水浴、容量瓶、秒表。

2、试剂：酪氨酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、新鲜土豆。

五、实验步骤及数据记录

1、溶液配制

1.1 酪氨酸溶液的配制

酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小，因而配制过程中需加入一定量盐酸溶解。首先称取一定量的酪氨酸配制0.1mol/L 酪氨酸储备液，在实验过程中稀释至0.02mol/L ，使用时需要加入一定量的NaOH 调节其pH 接近中性。

1.2 缓冲溶液的配置

首先分别配置0.2mol/L KH 2PO 4溶液0.2mol/L NaOH 溶液，然后以一定的体积比配置pH=6.0和pH=7.2的KH 2PO 4-NaOH 缓冲溶液。体积比如下表：

表1.1 KH

PO-NaOH缓冲溶液的体积比

2、酶的提取

取新鲜土豆，清洁后切碎，称取10.05g置于研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压和研碎，用两层纱布滤出提取液，立即高心分离5min，倾出上层清液保存于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。

3、酪氨酸最大吸收波长确定

取2.5mL酶提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释至10mL比色管中，摇匀。取0.4mL已稀释过的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的缓冲溶液，加入2.0mL酪氨酸溶液，摇匀。反应约数分钟后，于分光光度计上扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图。

表1.2 最大吸收波长的确定

图1.1 酪氨酸吸收光谱的绘制

由图1.1可知酪氨酸的最大吸收波长为450nm。

4、酶活性测量

分别取0.3、0.4、0.5mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入5.0mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入4.0mL酪氨酸溶液，同时开始计时，用分光光度计在450nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。以吸光