宠物食品中维生素B12的快速测定

宠物食品中维生素B12的快速测定
维生素B12（钻胺素）是一种重要的维生素，在保持宠物健康方面发挥着一些特殊作用。

维生素B12对于维持神经系统和细胞生长至关重要，同时在造血、改善大脑功能和维持良好的肠道健康方面也起着关键作用。

目前，对于维生素B12的检测主要集中于功能饮料、保健食品、配方奶粉和血清等领域，对于宠物食品中的维生素B12的检测鲜有报道。

根据美国饲料管理协会的要求，犬粮中维生素B12的最低含量为2.8ug∕100g,猫粮中维生素B12的最低含量为2.0ug∕100g o而欧盟饲料行业协会中规定，维生素B12在生长和繁育期犬粮和猫粮中的含量不得低于2.8ug/100g和1.8ug/100g,在成年期犬粮和猫粮中不得低于3.87ug/100g和2.35ug/100go维生素B12的常用检测方法包括HP1C法、HP1oMS法、酶联免疫法和微生物法，由于宠物食品的基质复杂且维生素B12的含量较低，微生物法是较为合适的选择，该方法虽然灵敏度较高，但由于操作烦琐，检测周期长，重复性差而不能被广泛应用。

本文拟对维生素B12的微生物测定法进行优化，将试管法改进为96孔微孔板法，对宠物食品中维生素B12的测定进行相关评价试验，
1试验用样品的制备
选取9份不含有维生素B12的宠物食品样品，包括3份全价猫粮基底、3份全价犬粮基底和3份成猫主食罐基底。

人工添加维生素B12标准品至9批样品中，使维生素B12含量分别为
1.Oug∕100g>5.0ug∕100g和10.0ug∕100g o
2.样品的前处理
称取1Og均质后的样品，将其加入50m1无菌离心管中，加入40m1去离子水，在95℃水浴中提取30min,每隔10min混匀1次(确保离心管密封)，然后快速冷却至30OC以下。

用0.22UnI无菌滤膜过滤取滤液。

根据维生素B12的浓度范围，在2m1无菌离心管中使用无菌水对滤液进一步稀释。

3.微孔板法检测
(1)配制维生素B12标准品
打开标准品瓶盖，取2.8m1无菌水加入标准品瓶中，盖上瓶盖，振荡使标准品充分溶解，即为标准品工作液。

取6个2m1无菌离心管，将标准品工作液分别稀释成0ug/100g、0.03ug/100g、0.06ug/100g、0.09ug/100g、0.12ug/100g和0.18ug/100go
(2)检测菌液的制备
向维生素B12培养基瓶中加入10m1无菌水，盖紧瓶盖，振荡溶解。

保证瓶盖密闭的前提下，95°C水浴加热5min,然后快速冷却至室温(低于30℃)o使用0.22UnI无菌滤膜过滤全部培养基，用
15πι1无菌离心管收集全部滤液。

向冻干菌株瓶内加入1m1无菌水，用移液枪吹打混匀，取其中的0.9m1加入过滤后的培养基中，振荡混匀，即为检测菌液。

(3)检测步骤
取出所需数量的微孔条置于微孔架上，依次将140U1标准品或样品、140U1检测菌液加入微孔中，然后用粘胶薄膜盖好微孔条，在37。

C培养箱中避光孵育44~48ho培养完成后，轻轻来回颠倒混匀微孔板，使菌液充分混匀，然后用一只手将微孔条固定于微孔架上，另一只手自右上方沿对角揭开粘胶薄膜，静置2min待气泡全部消去后用酶标仪在610~630rnn下测量浑浊度，使用四参数法进行结果计算。

4.微生物法与微孔板法的比较
分别使用国家标准《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》(GB5413.14—2010)与微孔板法对表1中所列9种宠物食品中的维生素B12进行测定，将这两种方法的检测结果进行比较研究，包括回收率分析及线性分析。

5.宠物食品样品检测
宠物食品分为湿粮和干粮两大类，根据产品形态不同，干粮可分为高温膨化粮、低温烘焙粮、冻干粮和风干粮等，湿粮可分为罐头和鲜食等。

据此，选择各品类共37个样品，分别使用微孔板法与微生物
1加标试验回收率分析
分别使用微孔板法和微生物法对表1所列9份宠物食品样品进行维生素B12的测定，计算各浓度水平的回收率，结果见表I o微生物法的回收率为94.0%~106.0%,而微孔板法的回收率稍低于微生物法，为93.0%~97.0%,回收率均能达到90%以上。

2.自然样品的检测结果
选择各品类共37个样品，分别使用微孔板法与微生物法进行检测，结果见表2。

对两种方法的结果进行显著性差异分析，单因素方差分析结果显示F<Fcrit,表明在各品类宠物食品中，两种方法的检测结
目前，微生物法是美国分析化学家协会和美国药典检测维生素B12的首选方法，但该方法操作烦琐，影响结果的因素多，对测试人员的要求高。

微孔板法的原理与微生物法基本一致，但极大程度上简化了操作流程，减少了菌种在保存传代中发生污染可能性，数据处理操作简便。

针对宠物食品特殊基质，进一步优化了提取流程，缩短检验周期，同时也减少了试验过程中因操作步骤烦琐引起的误差，与微生物法相比，具备良好的稳定性与准确性。

宠物食品主粮产品分为干粮和湿粮两类。

干粮主要特征是水分含量少、表面干燥、颗粒状，包括膨化粮、烘焙粮、风干粮和冻干粮等多种产品形态。

湿粮主要是糊状、水分含量高，主要有罐头和鲜食两种形态。

徐坤等2研究发现，宠物食品在挤压膨化、制粒及贮存过程中，各种维生素随着温度或时间的变化都有一定程度的损失。

经挤压加工后，宠物食品中脂类的氧化作用产生的氢过氧化物、过氧化物和环过氧化物等会引起维生素A、E等的氧化产生过氧化物，与活性的碳基反应造成维生素B。

等的破坏，糖类非酶褐变产生的高度活化的碳基对维生素同样具有破坏作用。

王红英等以维生素C为例，对制粒过程中的调质温度、蒸汽压力、喂料器的给料速度等因素进行了试验研究，提出了影响维生素稳定性的主要因素是调质温度和蒸汽压力。

葛建东
等也发现在制粒时调质用的蒸汽、高温以及挤压所造成的摩擦都是破坏维生素的主要因素。

膨化的调质温度和压力都高于制粒，破坏性更大，膨化时加入大量的水分也是一个重要影响因素。

本文测试了主要品类的猫粮及犬粮中的维生素B12,结果表明，维生素BZ在冻干猫粮中的平均含量最高，达到16.0ug/100g,而在高温膨化粮中的平均含量最低，仅为6.2ug/100g o需要说明的是，宠物罐头及鲜食虽然维生素B12的平均含量更低，但由于其含水量高达70Q90%,因此折算干基后维生素B12含量更高。

随着养宠渗透率的提升，并受益于宠物主对科学喂养理念的科普与产品认知的提高，越来越多的养宠人逐渐重视宠物的营养健康，国产宠物食品企业正在快速进阶，相关部门也应当加大监管力度，并制定相关检测标准和法规，促进我国宠物食品行业健康发展。