红细胞代用品的研究现状

红细胞代用品的研究现状
自1901年维也纳大学Landsteiner发现人类红细胞血型以来，输血已成为临床医疗的重要治疗手段。

虽
然输血对患者身体的恢复作用重要，但传染性疾病的传播、各种病原体的交叉感染、血型的失配、免疫反应、短暂的储存寿命以及筛选试验的高成本等也制约着输血的临床应用。

这诸多的问题要求我们寻求安全有效的红细胞代用品。

理想的红细胞代用品应具有良好的携氧和释氧的能力、无需交叉配型、无免疫反应、循环系统内存留时间久、不产生肾毒性等特点，因而红细胞代用品也被形象的定义为“携带氧气的扩容剂”[1]。

本文就近年来红细胞代用品的研究现状做一综述。

1 血红蛋白氧载体（hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs）
1．1 制备HBOCs 的血红蛋白（hemoglobin，Hb）来源
1．1．1 人外周血和胎盘血经纯化的人Hb 无免疫原性，可大量多次输入人体而不致引起补体的激
活，国际上普遍采用过期的库存血作为原料。

由于来源所限，难以大规模生产人源性HBOCs。

而在中国每年的新生儿超过2000 万，以每个胎盘可采血150ml 计算，其来源非常可观。

不足之处是HbF 含量较大，
氧亲和力较高，因而产品的质量会受到一定的影响。

1．1．2 动物血目前对来源丰富的动物Hb的研究取得了一定的进展。

其中以牛Hb为原料制备红细
胞代用品取得了良好的效果。

由于牛的Hb氧离曲线与人Hb相似，在血液中受氯离子控制无需2，3-DPG 类
似物的修饰即可达到很高的P50值，在低pH值组织中释氧能力强等特点，从而使得牛Hb一直是国内外研究
的聚焦点。

Conover等[2]对聚乙二醇(polyethylene glycol，EG)结合的牛Hb（PEG-b Hb）研究发现修饰后Hb
的稳定性和半寿期明显提高。

与未修饰的牛Hb相比，PEG-Hb不会导致平均动脉压的显著升高。

同时，EG 的结合也可降低牛Hb的免疫原性。

Hemopure (Hemoglobin Glutamer-250)是Biopure公司研制生产的戊二醛聚合牛Hb产品。

Hemopure室温下可储存3年之久。

临床前试验表明，Hemopure具有氧亲和力低、携氧与释
氧能力强等特点。

在临床试验期间，输入Hemopure后，约l/3的受试者无需再输入储存血液。

术中使用Hemopure患者有一定的耐受性，但在术后会逐步增加血液中高铁Hb的浓度[3]。

Hemopure已成功地用于择
期心血管和肝脏手术中，并未发现明显的毒副作用和免疫性问题[4]。

在肝脏切除术中，虽然Hb的浓度已达
到最大(10±2g/L)，但在尿液中并未检测到Hb，说明其在体内并未发生解聚。

以猪血为原料的红细胞代用品
的研究并不多，用戊二醛聚合猪Hb制备而成具有携氧、释氧和扩容功能的红细胞代用品，主要用于创伤等
导致的各类失血性休克、外科围术期等危重病的治疗。

除哺乳动物，人们还发现陆栖蚯蚓属血红蛋白(LtHb) 也可以应用于人工氧载体。

LtHb为十二聚体，稳定性好，可以抗氧化和分解，是一种天然非细胞性交联聚合Hb。

在中性pH条件下，LtHb的氧亲和性和协同性均与人类极为相似。

而且LtHb无免疫原性，其副作用
仅是短暂的白细胞升高。

天然的细胞内Hb作为人工氧载体值得研究[5]。

1．1．3 基因重组Hb 基因工程产品性能稳定、不易被污染和易于保存，其研究为人们所关注。

Hoffman 等[6]将α和β基因构建于同一表达载体，使α和β亚基在表达过程中即形成α2β2 四聚体，首次在转基因大肠
杆菌中表达出双 A 链融合的Hb。

这一方法避免了化学修饰的潜在毒副作用，同时双 A 链融合的Hb 稳
定
性明显增强。

同时其产品洁净，不被致病菌污染。

不足之处在于产率较低，纯化出正确折叠的蛋白所需成本较高，工艺亦较复杂。

转基因动物是生产基因重组人Hb(recombinant human hemoglobin，rhHb)的另一途径。

转基因动物表达人Hb 在鼠和猪中均获成功。

美国DNX 公司在1991 年成功地培育出生产人Hb 的转
基因猪，人Hb 量占猪总Hb 的10%~15%，并可继续提高。

基因工程Hb 避免了血源污染的可能，可经微
生物发酵大量生产，无须进一步修饰，不致引起免疫反应。

因此，其可成为一种安全有效的红细胞代用品。

1．2 HBOCs 的分类及相关进展
1．2．1 化学修饰HBOCs 1944 年Amberson 医生就曾用过未加修饰的人Hb，结果出现急性肾衰、
血管收缩和腹痛等严重毒副作用。

无基质Hb（SFH）缺乏尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸-高铁Hb 还原酶等保护，
Hb 分子内Fe2+易氧化生成高铁Hb，从而失去携氧能力并产生自由基。

同时，SFH 不含补体和细胞因子，Hb 在变成空泡状后可导致自由基和超氧离子的形成，而且释放的铁离子会导致细菌快速生长并可造成败血症。

SFH 在体内可解聚为小分子αβ二聚体或单体，在循环中的半寿期仅为2~4 小时；αβ二聚体或单体
易被肾小球滤过，具有肾毒性，并可引起血管收缩，对心血管系统造成损害，因而无法直接应用于临床。

必须对其进行修饰，稳定四聚体结构，同时对粘滞度和氧合及释放平衡等进行优化，减少对肾和血管的毒性。

天然SFH 含有大量的可进行修饰的活性基团，包括赖氨酸的ε-氨基、α链氨基端的游离α-氨基和β链的
两个巯基(Cys：F9(93) β)，而且绝大部分赖氨酸分布在分子表面，使得Hb 的化学修饰的操作性很强。

主
要化学修饰HBOCs 包括分子内交联Hb、表面修饰Hb 和聚合Hb。

1．2．1．1 分子内交联Hb 分子内交联Hb 是在多肽链中插入特殊的化学交联剂，避免天然Hb 的
解聚[7]。

常用交联剂有：双阿司匹林类化合物，如双(3，5-二溴水杨酸)延胡索酸(DBBF)等；吡哆醛类化合物，如磷酸吡哆醛( PLP)和硫酸吡哆醛(PLS)等[8]。

单、双水杨酸酯的溴化物是Hb的赖氨酸的酯化剂。

水杨酸酯的溴化可增强自身离子基团的活性，在与
琥珀酸或延胡索酸连接后形成双阿司匹林(DBBF)。

DBBF在脱氧条件下对人Hb的交联发生在Hb两个α亚基
各自第99位的赖氨酸(Lys)上，由于α亚基和β亚基之间的结合比较牢固，所以两个α亚基之间的交联就有效地防止了Hb四聚体结构的破坏。

通过控制反应物浓度的配比，可使DBBF的反应只发生在Hb的分子内部，
而不会出现大量分子间的交联。

DBBF交联产物比较均一，易控强，同时反应产物的氧亲和力得到改善[9]，曾一度成为红细胞代用品很有希望的研究方向。

美国Baxter公司将双阿司匹林分子内交联入血红蛋白(DCLHb)进行了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验，证实DCLHb不会产生细胞毒素或造成缺血组织损伤等。

但Ⅲ期临床后期发现，在对失血性休克伤员的抢救中没有表现出预期的效果，仍有一部分伤员死亡。

进而发现输入DCLHb会增加平均动脉压，易携带NO透过血管壁，引起血管收缩。

Baxter公司不得不中断临床试验而转向
新一代重组Hb的研制[9]。

5-磷酸吡哆醛(PLP)是2，3-DPG的结构类似物，可使Hbβ亚基的氨基端Val吡哆醛化；同时，与Hbβ亚基的2，3-DPG结合位点形成共价键可降低氧亲和力，但由此形成的四聚体不稳定。

为了克服PLP的缺点，人们相继合成了含2个吡哆醛的双醛基衍生物NFPLP，可与脱氧Hb反应，在β1(NA1)缬氨酸和β2(EF6)赖氨酸
间形成双键连接，降低天然Hb的氧亲和力并阻止其解聚。

1．2．1．2 表面修饰Hb 表面修饰Hb是将Hb与生物相容性好、在血液循环中停留时间久的葡聚糖、
菊粉、聚氧乙烯(POE)、聚乙二醇(PEG)等大分子相互连接，延长Hb的半衰期，减少Hb的解聚，降低肾毒性。

PEG具有良好的生物相容性，使Hb表面形成一层水“防护膜”，能降低蛋白质的免疫原性、增加有效分
子半径、延长Hb半衰期和提供与血液相似的粘滞度，防止血管收缩，保持正常携氧和释氧的能力，提高蛋
白质的生物利用度。

Winslow[10]研究发现PEG在前毛细血管储存氧，在低氧部位毛细血管处靶向释放，原因是其新的结构组成具有保持功能毛细血管密度和抑制血管收缩的特性。

Young等[11]在休克动物实验中通过与其他代用品比较，证明补充较小剂量的PEG后可以恢复氧输送功能，而无全身的血管收缩反应。

美国和瑞典已完成对Hemospan[MP4，聚乙二醇( PEG) 修饰的人Hb]的Ⅱ期临床研究，正在Ⅲ期临床试验。

德国Curacyte公司的PHP(表面聚氧乙烯结合的人血红蛋白) Ⅱ期临床研究已经完成，其能减少血管活性药物的
使用，适用于败血症休克患者。

美国Hemobiotech公司的Hemotech (牛Hb与磷酸腺苷和0-腺苷交联的产物) 的动物实验已经完成，正在临床研究阶段[12]。

1．2．1．3 聚合Hb (Polyhemoglobin) 聚合Hb以交联剂与Hb表面的活性基团(主要是赖氨酸侧链的氨基)反应，把四个亚基交联起来，增加四聚体的稳定性，同时还可进行分子间的聚合，生成多聚Hb，以达到增加稳定性、提高携氧能力、降低胶体渗透压的目的。

目前广泛使用的交联试剂主要有戊二醛和开环棉籽糖。

聚合Hb包括PolyHemeTM、Hemopure和Hemolink。

PolyHemeTM是美国Northfield Laboratories生产的吡
哆醛和戊二醛多聚Hb。

I 期临床试验以乳酸林格氏液为对照，健康受试者输入1U(500ml)PolyHemeTM后，未发现胃肠道不适，肾和其它脏器功能正常。

在北美，已应用6U (3000ml) PolyHemeTM于择期主动脉瘤手
术Ⅲ期临床试验中，其最大应用剂量可达到20U (20×500ml)，疗效与安全评估和天然全血或红细胞相比无明显差异，是现今美国唯一用于严重创伤者的Hb修饰产品[13]。

Hemopure(HBOC-201)是由戊二醛聚合的牛
Hb，各指标均接近人全血，而黏度只有全血的三分之一，在室温下可保存3年以上。

HBOC-201主要作为手
术期间的“桥梁”，可延缓输入库存血，在微循环中通过促进氧的传递和分布来增强输氧的能力[14]。

2001年
该产品通过了Ⅲ期临床试验，在南非被批准用于治疗成年患有急性贫血的外科手术病人，以减少外源性输血，而在美国被批准用于宠物治疗。

Kerby等对脑外伤病人的临床试验中应用HBOC-201进行复苏，发现HBOC-201可有效地保护自控机制，并可减少外伤性脑损伤病人的继发性脑损伤[15-16]。

同时，美国加利福
尼亚大学的Jahr等在Ⅲ期临床试验中发现，HBOC-201可安全应用于矫形外科手术中[17]。

而据南非一项临床研究显示，HBOC-201应用于一个仅有23个月的红细胞贫血合并心衰的女婴，血压由原来的70/30mmHg上
升到100/50mmHg[18]。

加拿大Hemosol公司将O-棉子糖上相邻的两个同位羟基用高碘酸盐氧化，生成二醛，
可与Hb上的氨基等基团反应，用于交联人Hb。

这种棉子糖衍生物交联Hb的反应产物含63%的聚合Hb 和37%
的分子内交联Hb [19]。

Hemosol公司在2000年就完成了Ⅱ期临床研究，后因公司破产而终止了这项研究。

目
前，Hemolink已完成整形外科手术、心血管手术和贫血症治疗等临床试验，进入Ⅲ期临床试验阶段。

1．2．2 微囊化Hb 1957年人们第一次用聚合物膜将Hb包起来，已经历了三代脂质包裹体(LEH)的发
展。

并于1964年提出了“人工红细胞”的概念[20]。

第三代LEH直径可小至0.2~0.5μm，黏度可调至与全血相同，
其脂质双分子膜基本无流动性，在输入体内后，首先被肝、脾的巨噬细胞迅速清除，然后由肝脾以外的网状内皮细胞系统清除，减小LEH的体积，可减缓被清除，使其血浆半衰期延长，但是LEH在动物实验中因
内皮系统巨噬细胞吞噬了大量的LEH，故大体积的LEH造成网状内皮系统封闭，导致吞噬饱和而引起机体免疫功能受损，造成部分换血实验的动物死于感染性休克。

其次，因LEH表面带有负电荷且体积较红细胞小，易导致血沉减慢，凝血功能下降，现已将研究重点转移对生物降解纳米材料包囊Hb(人工红细胞)的研发。

与传统红细胞代用品相比，可生物降解聚合物包裹的Hb纳米囊具有以下特点[21-22]：(1)采用的新型纳米
材料在体内可降解成水和二氧化碳，降解速率可进行调节；(2)聚合物比脂质体牢固、通透性好、膜的用量少，具有透过葡萄糖和其他亲水小分子能力；(3)Hb纳米囊的直径控制在80~150nm，约为天然红细胞的1/60，在发生循环障碍时，可携氧与释氧；(4)不易通过血管内皮缝隙进入组织间质，克服了无基质Hb分子与NO 结合造成的血管收缩和血压上升的危害；(5)可将超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、MetHb还原酶等影响Hb 携氧能力的酶包含在纳米囊中；(6)可将Hb纳米囊制备成冻干制剂，便于储存和运输。

Chang等[21]在生物可
降解膜及纳米技术的基础上制得粒径在80~150nm范围内的纳米人工红细胞。

最新研究表明，聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)共聚物作囊材可极大地延长纳米人工红细胞在体内的半衰期，使其为聚合Hb的2倍。

2 全氟化碳化合物(PFC)
PFC是将碳氢化合物中的氢原子全部由氟原子替代，形成的类环状或直链状有机化合物。

医学上常用
的PFC碳原子为8~12个，常温下为无色、无味、无毒的透明液体，粘度低于血液而稍高于水，密度高，表
面张力低，化学性质稳定，在体内不发生代谢，除能溶解一些气体和极少数物质外，对蛋白质、脂类、糖类和无机盐完全不相溶，与血液也不相混合。

在配制成红细胞氧载体时，必须制成不溶于水的乳胶微粒[23]。

自1966年美国Cincinnati大学的Clark研制成功第一个氟化碳化合物的红细胞代用品以来，氟化碳化合物材料
发展迅速，目前研发的PFC已有三代。

第一代以Fluosol-DA20为代表，美国FDA批准用于临床冠状动脉血
管成形术，以增加机体的氧供，临床研究发现其能减少术中心脏的损伤和疼痛[24]。

第二代全氟化碳乳剂使
用蛋黄磷酯( EYP)作为乳化剂，研究最为广泛的为全氟萘烷双环化合物和潘氟隆(perflubron)。

HemoGen公司研制的Oxyfluor和Therox中全氟化碳的含量都明显提高，从而提高了携氧的能力。

Alliance制药公司研制
的Oxygent AF0144含有58%(w/v) 潘氟隆，其蛋黄磷酯乳化物在5~10℃下的储存时间超过1年，冷冻可保存
2年。

但Alliance公司在对其产品进行Ⅲ期临床应用阶段发现，使用Oxygent的冠状动脉旁路血管移植术患者
脑血管事件的发生率明显升高，试验随之停止。

近期又有另一种氟化碳类化合物产品Perftoran，主要成分为氟萘烷和氟甲基一环己基哌啶，已在俄罗斯获准上市医用[25]。

目前，第三代产品正处于临床前的研发阶段。