紫外线—氯化锂诱变选育吡咯喹啉醌高产菌

紫外线—氯化锂诱变选育吡咯喹啉醌高产菌
王朝绚;李会玉;王爽;葛喜珍
【摘要】以K.pneumoniae为出发菌株,通过紫外线和氯化锂诱变筛选PQQ高产菌.结果表明,当紫外照射时间为45s时,致死率为85％;当氯化锂剂量为0.3％时,致死率达85％.紫外诱变所得菌株U1和U2的PQQ产量分别是出发菌株的2.7倍和6倍.氯化锂诱变所得菌株L1的PQQ产量是出发菌株的5倍.紫外线和氯化锂复合诱变所得菌株F1的PQQ产量是出发菌株的1.4倍.紫外诱变所得菌株U2经连续传代15次,其PQQ产量仍能达到原代菌的95％,表明该菌能稳定生产PQQ.该研究为进一步提高PQQ产量奠定了基础.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2013(000)034
【总页数】4页(P13103-13105,13122)
【关键词】吡咯喹啉醌;肺炎克雷伯氏菌;紫外线;氯化锂;诱变
【作者】王朝绚;李会玉;王爽;葛喜珍
【作者单位】北京联合大学生物化学工程学院,北京100023;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京联合大学生物化学工程学院,北京100023;北京联合大学生物化学工程学院,北京100023
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.92;S476.9
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ）是不同于NAD/NADP和
FMN/FAD 的第3 类新型辅酶［1－2］。

其独特的邻苯醌结构赋予其许多不同于
其他辅酶的生理调节活性。

PQQ是许多氧化还原酶的辅基，参与呼吸链电子传递；促进机体生长和神经生长因子合成，具有抗氧化、清除自由基等功能；刺激高等植物花粉萌发和花粉管延长，并且可参与植物雄蕊的授粉作用；甚至被作为人体必需的营养因子归入B族维生素；临床研究证明，许多神经系统疾病(如阿尔茨海默氏症）和其他慢性退行性疾病与PQQ缺乏有关［3－6］。

可见PQQ具有重要开发应用价值。

目前PQQ造价昂贵，化学合成法步骤多且难分离，成本很高。

微生物发酵生产PQQ是业界公认的技术路线，但迄今发现能产生PQQ的生物仅限某些革兰氏阴
性细菌，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae）［7］、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens）［8－9］等，且仅能合成供自身生长代谢所需的痕量PQQ，不能用于工业发酵生产。

PQQ的生物合成涉及成簇排列的4～7个基因，有的连续排列成一个基因簇，如肺炎克雷伯氏菌［10］；有的则分布在2
个基因簇中，如扭脱甲基杆菌含有pqqABCDE和pqqFG 2个基因簇［11］。

虽然代谢工程中重排菌种代谢流量是近年来分子育种的研究热点，但由于PQQ的生物合成机制尚未完全阐明，故定向改造其代谢途径尚存在较大难度。

相比之下，诱变育种操作简单、速度快，可大幅度改良某些性状。

常用的诱变剂可分为物理、化学和生物诱变剂3大类。

该研究以野生型肺炎克雷伯氏菌为出发菌株，采用紫
外诱变、氯化锂诱变、以及两者复合诱变的方法，用非酶法检测PQQ产量，同时分析了影响PQQ产量的限制因素并考察诱变菌株的遗传稳定性。

1.1 材料
1.1.1 出发菌株与培养基。

肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae DSM2026，以下简写为K.p）。

溶菌肉汤(LB）液体培养基:蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠
10 g/L，pH 7.0，固体培养基需加入15 g/L的琼脂。

1.1.2 试剂。

NBT-Gly溶液［12］:20 mmol/L 磷酸盐缓冲液(含0.2mol/LNaH2 PO4、0.2mol/LNa2 HPO4，pH 7.0）；NBTGlyK+溶液［预先配制2 mol/L
Gly-KOH溶液(pH 10），使用时加入(硝基四唑兰）NBT(终浓度0.24
mmol/L）］。

1.2 方法
1.2.1 紫外线诱变。

出发菌株在LB培养基中培养至对数生长期，制备梯度稀释10－7的悬浊液，取100μl涂板，15 W紫外灯竖直距离30 cm照射，37℃避光培
养12 h。

根据所得致死率曲线，确定菌株致死率为80%的诱变条件。

1.2.2 氯化锂诱变。

将培养至对数生长期的出发菌株制成梯度稀释10－7的悬浊液，取100μl涂布于氯化锂浓度梯度平板上(氯化锂质量分数分别为 0.1%、0.2%、
0.3%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%），37 ℃培养 12 h，挑取菌落进行筛选。

根
据所得的致死率曲线，对菌株采取80%左右致死率的诱变条件进行诱变。

1.2.3 紫外线—氯化锂复合诱变。

采用氯化锂、紫外诱变致死率均为80%的条件进行复合诱变，37℃避光培养12 h，挑单菌落进行筛选。

1.2.4 筛选与检测。

PQQ 采用 NBT-Gly法检测［11］，具体操作方法如下:配制
含20 μl发酵液、80 μl PBS、180 μlGly-KOH和20μl NBT的300μl反应体系，30℃反应1 h，将反应液稀释10倍，吸打混匀，加入96孔酶标板，酶标仪检测，以LB培养基为对照，测定OD530，PQQ产量与OD值成正比。

挑取诱变后平板上的菌落，接种于4 ml LB培养基，培养12 h后采用NBT-Gly法测定PQQ产量进行初筛。

对初筛所得菌株进行传代培养，检测PQQ产量的稳定性。

1.2.5 突变菌株U2产PQQ检测。

将产量最高的突变株U2在斜面培养基上传代
15次，再将各子代菌株分别接种入发酵培养基中，37℃150 r/min摇瓶培养12 h；离心，取上清，用NBT-Gly法测定PQQ产量，确定突变株U2经多次传代后产
PQQ的稳定性，防止回复突变。

1.2.6 统计学分析。

试验设3次重复，计算平均值及标准差，对生物量和PQQ产
量进行统计分析。

2.1 紫外线诱变由图1可知，随着时间延长，菌株的死亡率变大，在45 s时，菌株的致死率达85%，45 s后菌株死亡率达90%，可见菌株对紫外线较敏感，选定45 s为紫外线照射时间。

诱变结果:从照射45 s的平板上挑取单菌落进行活化和培养，采用NBT-Gly法测
定PQQ量。

经过多次诱变，每次挑取100株菌进行检测，筛选出产量高于出发
菌株K.p的7株菌(表1）。

将这几株菌进行传代发酵，传6代后有2株菌的PQQ产量稳定且高于出发菌株，分别命名为U1和U2，如图2所示。

2.2 氯化锂诱变由图3可知，随着氯化锂浓度提高，菌株的死亡率上升。

当浓度
为0.01% ～0.3%时，随浓度升高菌株的死亡率迅速增加；当浓度为0.3%时，菌
株的致死率达85%；当浓度高于0.4%之后，死亡率基本维持稳定；当浓度为1.2%时，死亡率达93%以上。

综合考虑，该试验选择0.3%氯化锂为诱变剂量。

诱变结果:从浓度为0.3%的氯化锂平板上挑取单菌落，采用NBT-Gly法测定PQQ 含量。

经过多次诱变每次挑取100株菌进行检测，筛选比出发菌株产量高的2株菌，标记为L1、L2(表 2）。

将这2株菌进行传代发酵，传6代后有1株菌产量稳定，且比出发菌株高，产量
如图4所示。

将得到的这几株菌分别进行单因素的二次诱变，挑取菌株进行检测，PQQ产量无明显提高，故不采取二次诱变。

由此可见，氯化锂诱变提高PQQ产量的可能性较小。

2.3 紫外线—氯化锂复合诱变以氯化锂浓度0.3%、紫外线照射45 s的条件进行
复合诱变，从平板上挑取单菌落，采用NBT-Gly法测定PQQ颜色反应后的OD 值，挑选比出发菌株产量高的1株菌(表3）。

通过紫外—氯化锂复合诱变，得到1株高产菌，产量是出发菌株的1.4倍，与2种单因素诱变结果相比，产量提高幅度不大，推测是双重诱变对菌株损伤太大。

作为一种辅酶，PQQ的产量过高可能会干扰多种代谢活动，从而影响菌体自身的生长，所以复合诱变未必是高产育种的策略。

但是，该研究结果并不否定复合诱变用于其他育种的可行性。

例如，刘芳宁以紫外线与氯化锂复合诱变选育高产乳糖酶的米曲霉，其乳糖酶活力比出发菌株提高了58.82%，比使用紫外照射诱变获得的产乳糖酶能力增加幅度很大［13］。

因此，若想进一步提高PQQ产量，需要针对性地改造代谢通路。

对单因素诱变得到的3株高产菌进行发酵检测。

由生长曲线图5可知，紫外诱变及氯化锂诱变后的菌株与出发菌株相比，生长初期差别不大，后期生长速度稍有提高，分别比出发菌株提高了0.59%、2.89%和13.3%。

同时在发酵过程中利用NBT-Gly法测定PQQ产量，由图6可知，诱变所得几株菌的PQQ产量均高于出发菌株，且在发酵10 h时，U2和L1的PQQ产量达到最高，分别是出发菌株的6倍和5倍；16 h时U1产量达到最高，为出发菌株的2.7倍。

出发菌株在发酵过程中，PQQ产量波动较小，PQQ产量低于诱变菌株。

2.4 突变株U2的遗传稳定性试验结果显示，突变株U2传至第15代后其PQQ 产量仍可达到原来的95%(图7）。

由此可见，突变株U2能稳定生产PQQ，由紫外诱变获得的U2菌株可作为基因改造的出发菌株。

紫外线是一种最常用的物理诱变因素，其诱变效应主要是紫外线引起DNA结构的改变，或者是基因表达量的变化。

该方法操作简便、效果理想、安全可靠，被广泛用于微生物的菌种选育［14］。

该研究发现，出发菌株K.pneumoniae对紫外线较为敏感，因此紫外诱变是获得PQQ高产菌的有效方法。

紫外诱变育种的机理非常复杂，无论导致关键
基因发生突变，还是基因表达丰度发生变化，均最终表现为代谢流量的改变，其详尽作用机制尚待进一步研究。

以K.pneumoniae为出发菌株，利用紫外线进行诱变，所得菌株U1和U2的PQQ产量较高，分别是出发菌株的2.7倍和6倍。

利用氯化锂诱变所得菌株L1的PQQ产量是出发菌株的5倍。

利用紫外线和氯化锂复合诱变所得菌株F1的PQQ产量是出发菌株的1.4倍。

由于PQQ作为辅酶，其产量过高会限制菌株的生长，复合诱变因为造成过于剧烈的代谢扰动，反而未能使PQQ产量高于单因素诱变。

选取U2突变株传至15代，其PQQ仍能保持95%，表明该菌能够稳定地生产PQQ。

紫外线诱变是获得PQQ高产菌的有效策略。

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