《生物技术制药》课件 (2)精品PPT

有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞 培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。第一次 克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的 RPMI1640培养液。由于单个细胞难以存活，克隆化时也需加 入饲养细胞辅助其生长。
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三、筛选阳(Yang)性克隆与克隆化
链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类 型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗 体的鼠源性，相对分子质量(Liang)只有完整抗体 分子的1/80~1/3，而且鼠源性单克隆抗体的 生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免 疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 等，只保留同抗原特异性结合的活性。
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三、筛选阳性克隆与(Yu)克隆化
（1）筛选阳性克隆： 因为产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右，
所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳 性克隆，然后进行克隆化培养。 为了尽快地筛选出阳性克隆，必须采用微量、快速、特异、敏 感、简便并一次能检测大批标本的方法。常用的检测方法有免 疫(Yi)酶技术、免疫(Yi)荧光技术和放射免疫(Yi)技术等。一般来说， 免疫(Yi)酶技术和放射免疫(Yi)技术均适用于可溶性抗原及颗粒性 抗原的抗体检测。免疫(Yi)荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测， 特别是制备以检测患者活检组织标本为目的的抗体时，免疫(Yi) 荧光法更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进 行定位判定。
1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种 （）球蛋白、乙种（ ）球蛋白和丙种（ ）球蛋白，并证明
抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。 20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。
1975年：Köhler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度特异 性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。
内，进行初次免疫，间隔2~4周，再用不加佐剂的原抗原追加免 疫1~2次。一般在采集脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其 目的是使对应的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使 其迅速地增殖分裂，因为细胞融合后增殖最好的细胞是迅速分 裂的细胞。有人认为在常规免疫的基础上用脾内免疫法做追加 免疫较佳。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 抗原
脾
(Pi)
B淋巴细胞
淋巴细胞 骨髓瘤细胞
融合
融合
单克(Ke)隆抗体和 多克(Ke)隆抗体的 制备
克隆1 克隆2 克隆3 克隆4
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第二节 单克隆 抗体 (Long)
一、抗原与动物免疫 二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培(Pei)
养 三、筛选阳性克隆与克隆化 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 五、单克隆抗体的大量制备 六、单克隆抗体的纯化
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一、抗原与动物免(Mian)疫
（3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法
体外免疫法：用于不能采用体内免疫法的情况下， 如制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原性 极弱且能引起免疫抑制时使用。
体外免疫法所需要的抗原量少，一般只需几个g， 免疫期短，仅4~5天，干扰因素少，已成功制备 出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4~8周 龄BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液(Ye)，再加 入37适℃当下抗培原养使4~其5天浓，度再达分0.离5~脾5 脏g细/m胞l，，在进5%行C细O2胞、 融合。
1984年：人-鼠嵌合抗体 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，
可仅作为与抗原特异性结(Jie)合试剂。
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单克隆抗(Kang)体的应用
用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测 与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放 射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免 疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有 的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。
染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能稳 定分泌高效价的抗体，而染色体数目少且比较 分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。
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二、细胞融合(He)与杂交瘤细胞的选择性培养
（6）饲养细胞： 由于在最适的条件下大约有105个脾细胞才能形成
一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相 继(Ji)死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不能存 活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。
常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和 胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长 刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依 赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故 应用的较多。
（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法 软琼脂法是在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝
胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于(Yu)培养基 是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块 打碎后，移入96孔板中继续培养。用这种方法可 以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不 易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。
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二、细胞融合与杂(Za)交瘤细胞的选择性培养
（4）培养基的正确选择：常用的选择培养基为 HAT培养基，它是次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A） 和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A） 能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和 瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞 和瘤细胞在这样(Yang)的条件下，几天内亦迅速死 亡。由于SP2/0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤（H） 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT）缺乏株，脾细 胞中却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞 可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶 （T）合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长
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四、杂交瘤细胞与抗体(Ti)性状的鉴定
（1）杂交瘤细胞的鉴定 正常鼠的脾细胞染色体数为40，全部是端着丝
粒染色体。小鼠骨髓瘤细胞的染色体数变异较 大，SP2/0细胞为62~68，NS-1细胞为54~64，大 多数为非整倍性，并且有中部着丝点染色体和 亚中部着丝点染色体。杂交瘤细胞的染色体在 数目上接近两种亲(Qin)本细胞染色体数目的总和， 在结构上除多数为端着丝粒染色体外，还应出 现少数标志染色体。
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一、抗原与(Yu)动物免疫
（2）稳定的杂交瘤的获(Huo)得
因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离 越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用与骨 髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的 骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此 免疫动物也多采用相应的品系，最常用的也是 BALB/c小鼠。
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二、细胞融合与(Yu)杂交瘤细胞的选择性培养
（5）选择性培养方法：通常将融合的细胞悬浮 于HAT的培养液（配方见书中表4-2），加入到含 有饲养细胞的96孔板内，根据情况每2~3天换(Huan) 液一次。换(Huan)液时吸去1/2~2/3培养液，加入等 量的新鲜培养液。在融合后7天内用HAT培养液， 杀死瘤-瘤融合细胞后，第7~14天改用HT培养液， 14天以后用普通的RPMI1640 完全培养液（配方 书中表4-3），从融合后8~9天就可对所有克隆生 长孔的培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体 的阳性克隆。
分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定 等特点。书中表4-1列举了主要的骨髓瘤细胞系，其中SP2/0、 P3.653细胞本身不分泌抗体，细胞融合后产生的杂交瘤细胞只分 泌均一的、完全来自脾细胞的抗体分子，它们是目前较为理想的 可供融合的骨髓瘤细胞。特别是SP2/0细胞系还具有容易培养、 融合率高等特点，被国内外多个实验室广泛采用。
第二节(Jie) 单克隆抗体
单克隆抗体是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞 融合，通过有限稀(Xi)释法及克隆化使杂交瘤 细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。由 于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体， 又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，因此称 为单克隆抗体。它是结构和特异性完全相同 的高纯度抗体。制备的一般流程见下图。
单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要 解(Jie)决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的 免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大， 难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。
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单克隆抗体的(De)应用
基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。 已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单
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一、抗原与动(Dong)物免疫
（1）制备用于动物免疫的适当抗原。
化学合成抗原，如精制的地高辛。 多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚至是极不纯的
混合物，如部分纯化的干扰素。 通过克隆化选出最适当的单克隆抗体。
在制备恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时，情况 较复杂，需用整个肿瘤细胞做为免疫原，经过筛选、 克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正(Zheng) 常细胞上的表面标志分子上的单克隆抗体。
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二、细胞融合与杂交瘤细胞的(De)选择性培养
（1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤 细胞（2 ×107 ~3×107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作(Zuo)用 下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG
融合液缓慢稀释。 （2）用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件：融合率高，自身不
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二、细(Xi)胞融合与杂交瘤细(Xi)胞的选择性培养
（3）诱导剂PEG的影响：PEG分子量以及浓度越 大，促融率越高。但其粘度和对细胞的毒性也随 (Sui)之增大。目前常用的PEG的浓度为40%~50%， 相对分子质量以4000为佳。但相对分子量 400~6000，浓度在10%~50%范围之间的PEG都能 使细胞融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加 入二甲基亚砜(DMSO），以提高细胞接触的紧密 性，增加融合率。但是，PEG和DMSO都对细胞有 毒性，必须严格限制它们和细胞的接触时间，可 通过低速离心5min使细胞接触更为紧密，然后用 新配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞。
选择动物时应考虑到动物品系的免疫应答基因 （Ir）对抗原免疫应答的影响。不同品系的小鼠 与大鼠在对某类抗原的免疫应答上是不同的。书 中表4-1是骨髓瘤细胞系一览表，可以参考。
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一、抗原与动(Dong)物免疫
（3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法
体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多(Duo)时应用，一 般用8~12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞抗原） 的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行 初次免疫，间隔1~3周，再追加免疫1~2次，可溶性抗原则 按每只小鼠10~100g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔
生物技术(Shu)制药
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第 四章 (Di) 抗体制药
第一(Yi)节 概述 第二节 单克隆抗体 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 第四节 基因工程抗体和抗体工程 第五节 抗体诊断试剂 第六节 抗体治疗药物
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第一节(Jie) 概述
1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了 血清疗法，开抗体制药之先河。
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ELISA用于破伤风抗体的筛选
1、精制破伤(Shang)风毒素抗原（ ）吸 附
（约(Yue)10g/ml，4℃，3h）
洗涤
2、加杂交瘤培养上清液（ ） （4℃，1h）
洗涤
3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗 体（ ） （4℃，1h）
洗涤
4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克 隆孔
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三(San)、筛选阳性克隆与克隆化
（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法 筛选出来的阳性克隆中，可能含(Han)有不分泌抗体的细胞或有多
株分泌抗体的细胞 ，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染 色体容易丢失，因此应尽早克隆化。 一般融合后获得的 杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达 到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀 释法和软琼脂法。