组织培养复习题
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组织培养复习题
一、概念
1 愈伤组织;
2 脱分化;
3 再分化;
4 外植体;
5 初代培养;
6 继代培养
二、填空
1.根据外植体材料的不同,将植物组织培养分为()()、()、()、()。
2.植物组织培养发展可分为三个阶段()、()、()。
三、问答题
1.什么是细胞全能性学说?如何理解?
2.什么是植物组织培养?
3.植物组织培养常用的激素哪些类型?各类激素又有哪些常用种类?
4.如何利用植物激素调控愈伤组织形态的发生?形态发生有哪些途径?
5.植物组织培养的主要类型有哪些?
一、名词解释
周期细胞
G0期细胞
终端化细胞
胚状体
器官发生
体细胞胚胎发生
二、问答题
1. 优良愈伤组织的特点?
2. 禾本科的愈伤组织的类型?
3. 体细胞胚胎发生与器官发生的区别?
4. 体细胞胚与合子胚的比较?
5. 如何诱导产生高质量的体细胞胚?
6. 器官发生的基本方式有哪些?
一、名词解释
胚培养
培养基
胚乳培养
植物离体授粉
胚珠培养
子房培养
胚乳看护培养
二、问答题
1. 简述离体胚培养的三种发育方式?
2. 幼胚培养的关键技术?
3. 植物离体授粉程序?
4. 简述胚的5个发育阶段?
5. 为何幼胚比成熟胚培养要求的培养基成分复杂?
一、名词解释:
1 单倍体
2 P-花粉
3 看护培养法
4 白化苗现象
5 花药培养
6 花粉培养
二、填空:
1 单倍体细胞培养主要包括三个方面()、()、()。
2 花粉培养的方法()、()、()、()、()。
3 花粉培养的实质是(),花药培养的实质是()。
三、问答题:
1 离体培养条件下的小孢子发育途径
2 花药培养前给予一定的低温处理的意义
3 影响花药培养的因素
一、名词解释
1.植物快繁
2. 丛生芽
3. 原球茎
4.驯化
5.玻璃化现象
6. 褐化现象
7. 黄化现象
8.无性系9.无性系变异
二、问答题
1.简述植物快繁器官形成的5种方式及其特点?
2.简述植物快繁的程序?
3.试管苗移栽的步骤?
一、名词解释
1.茎尖
2.原原种
3.原种
4.微体嫁接法
5.珠心组织培养脱毒法
二、问答题
1.简述植物脱毒方法的种类?
2.简述植物茎尖脱毒方法的原理?
3.如何进行脱毒效果的检测?
组织培养的历史
虽然组织培养技术的蓬勃发展近50年。
但它的整个历史可以追溯到上世纪初。
组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段:
萌芽阶段(从20世纪初至20世纪30年代中)
奠基阶段(从20世纪30年代末到20世纪50年代中)
快速发展阶段和应用阶段(从20世纪50年代到现代)
萌芽阶段(从20世纪初至20世纪30年代中)
Schleiden和Schwann所提出的细胞学说
德国植物生理学家Haberlandt于1902年提出了高等植物的器官和组织可以分割,
直至分到单个细胞观点和细胞全能性观
点。
Hannig 1904年在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚,并使这些胚在离
体条件下长到成熟。
Laibach 1925,1929年把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子胚剥出,培养至成
熟,证明了胚培养在植物远缘杂交中利用
的可能性。
奠基阶段(从20世纪30年代中至20世纪50年代末)
30年代两个重要的发现,一是认识了B 族维生素对植物生长的重要意义;二是发
现了生长素--一种天然的生长调节物质。
1934年,White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系,使根的离体培养实验首
次获得了真正的成功。
用3种B族维生素,
即吡哆醇、硫胺素和烟酸,取代酵母浸出
液获得成功,后被称为White培养基。
Gautheret(1934)在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后,山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。
揭示了B 族维生素和生长素的重要意义,1939年连续培养胡萝卜根形成获得首次成功。
同年,white 由烟草种间杂种的瘤组织,Nobecourt由胡萝卜也建立了类似的连续生长的组织培养物。
Gautheret,White和
Nobecourt被誉为植物组织培养的奠基人。
40年代和50年代初期,Skoog等确定了腺嘌呤与生长素的比例控制芽和根形成的主要条件之一,利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化。
50年代开始以后的10年中,研究进展有以下6项:①1952年,Morel和Martin首次证实,通过茎尖分生组织离体培养,可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。
②1953~1954年,Muir进行单细胞培养获得初步成功,对分离的单细胞进行了“看护培养”。
实现Haberlandt培养单细胞可能性的这一设想。
③1955年,Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出细胞分裂素,并把它定名为激动素(kinetin)。
④1957年,Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念。
⑤1958年,Wickson和Thimann应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
⑥1958~1959年,Reinert和Steward分别报道,在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。
这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。
现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。
在有些植物任何部分都可以得到体细胞胚,如胡萝卜和毛茛上。
迅快发展阶段(从20世纪60年代至现在)(l)原生质体培养取得重大突破
1960年Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。
1971年,Takebe等烟草由原生质体获得了再生植株,这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外,无壁的原生质体同样具有全能性,而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。
(2)细胞融合技术应运而生
1972年,Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合,获得了第一个体细胞杂种,后来在有性亲合及有性不亲合的亲本之间,不同作者又获得了若干其他的体细胞杂种。
(3)花药培养取得显著成绩
1964年,Guha和Maheshwari报道,在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。
1967年,Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。
由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用,这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展,获得成功的物种数目增加到180余种,其中包括很多种重要的栽培植物。
烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。
(4)微繁技术得到广泛应用
1960年,Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法。
繁殖系数极高。
由于这一方法有巨大的实用价值,很快被兰花生产者所采用,迅速建立起“兰花工业”。
目前,用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。
除兰花外,在其他很多观赏植物和经济作物(如甘蔗和草莓等)中,快繁也已达到了工厂化生产规模,在若干作物中与通过茎尖培养进行脱毒相结合,产生了可观的经济效益。
(5)转基因技术的应用
中国是全球最早研究与开发、种植转基因作物的国家之一。
截止2006年,农业部共受理了192家国内外研究单位的安全评价申请1525项,经国家农业转基因生物委员会评审,共批准了转基因生物中间实验456项,生产性试验181项,环境释放211项,安全证书176项,已经批准了转基因抗虫棉花,抗病毒木瓜,延熟番茄,抗病毒甜椒等的商业化种植。
转基因植物的大面积推广应用在创造了巨大的经济效益的同时,还在减少使用农药,增加农民收入与降低农田环境污染方面做出了积极的贡献。
组织培养在农业中的应用可以有以下10个方面
(1)组织培养是转基因技术不可或缺的组成部分,无论是转基因受体的提供,还是转化细胞的筛选和再生,都需要有组织培养技术作为支撑。
(2)在自花授粉作物杂交育种中,或在异花授粉作物自交系选育过程中,采用花药培养技术不但可缩短杂合体纯合化所需的时间,而且还可以节省土地面积。
(3)在某些雌雄异株植物(如石刁柏)中,若把花药培养技术包括到制种程序中去,在后代就有可能得到均匀一致的单性群体,提高经济效益。
(4)在远缘杂交中,通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障碍,在通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍,通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。
(5)对于无药可治的病毒病,可通过茎尖培养消除病毒,这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要的作用,在其他很多植物中也可用以建立无毒原种。
(6)通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝,可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。
(7)应用在细胞水平上进行突变体选择的技术,可以在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化,从而大大提高选择效率,节省时间和土地面积,并且不受季节的限制。
(8)体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源。
(9)通过用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子,为某些稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段。
(10)在无性繁殖植物中,通过对茎尖分生组织等离体材料进行超低温保存,不但可以大大节省空间,而且还可以避免病虫害的侵袭。
19世纪末期,德国的A.Mayer发现烟草上出现深浅相间的绿色条纹,称之为烟草花叶病
植物组织培养是指在无菌和人工控制的条件下,利用适当的培养基,对离体的植物器官(如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、花药、子房等)、组织(如形成层、皮层、胚乳等)、细胞(如体细胞、生殖细胞花粉等)、原生质、幼小的植株进行培养,使其再生细胞或完整的植株的技术。
由于培养的植物材料已经脱离的母体,也称植物离体培养。
无菌(asepsis ) :使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、
病毒等微生物的状态,以保证植物材料在
培养皿中正常生长和发育。
人工控制的环境:光照(1000-1500lx)、温度、湿度(70-80﹪)、气体(CO2)等。
外植体(explant) :由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。
离
体培养的材料,包括:器官、组织、细胞、
原生质体。
愈伤组织:原义---植物在受伤之后在伤口表面形成的一团薄壁组织;在组织培养
中指在人工培养基上由外植体长出来的
一团无序生长的薄壁细胞
培养基(culture medium ) :是植物组织培养的重要基质,为培养物提供生
长发育及分化的营养物质及支持。
培养基的营养组成:
1、无机营养大量元素:氮、磷、钾、硫、
钙、镁;
2、无机营养微量元素:铁、硼、锰、铜、
锌、钼、氯
3、有机营养:维生素、肌醇、氨基酸等
4、植物生长调节剂:生长素类(2,4-D、
NAA、IAA、IBA)细胞分裂素类(KT BA ZT )
其他类(GA ABA)
5、附加物: 琼脂、活性碳、一些天然复合
物
组织培养分为五种类型:
1、愈伤组织培养
2、细胞培养
3、器官培养(胚、花药、子房、根、茎、叶)
4、茎尖分生组织培养(脱毒)
5、原生质体培养
组织培养的生理依据
1.细胞全能性学说
植物体的每一个细胞都含有一个完整个体的全套基因,这些基因在适宜的外界条件下按照某种特定的程序先后表达,最终分化形成一个完整的植株,称为细胞全能性(totipotency)
全能性只是一种可能性。
要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件:
一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来,也就是说必须使部分细胞处于离体的条件下。
二是要给予它们适当的刺激,即给予它们一定的营养物质,并使它们受到一定的激素的作用。
一个已分化的细胞要表现它的全能性,必须经历两个过程,即首先要经历脱分化过程,然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式:一是器官发生方式;二是胚胎发生方式
脱分化一个成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的现象叫做脱分化。
再分化一个成熟的植物细胞经历了脱分化之后,经过培养还能形成完整的植株,这个过程叫再分化。
再生:指组织、器官、悬浮细胞和原生质体经培养后获得植株的过程。
继代:植物组织培养过程中,外植体在培养基上培养一段时间以后需要转移到新的培养基上进行培养,这称为继代。
2.激素(植物生长调节剂)调控
生长素类
*作用:主要被用于诱导愈伤组织形成;促进细胞脱分化;促进细胞伸长;促进生根。
在促进生长方面,根对生长素最敏感。
在极低的浓度下,(10-5—10-8mg/L)就可促进生长,其次是茎和芽。
细胞分裂素
作用:①促进细胞分裂与扩大。
②诱导芽分化,促进侧芽萌发,使茎增粗,抑制茎伸长。
③抑制根的分化。
GA3(赤霉酸):
作用:促进幼芽伸长生长,促进不定胚发育成小植株。
赤霉素和生长素协同作用,对形成层的分化有影响:当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化,比值低时有利于韧皮部分化。
固体培养基的特点(与液体培养基相比):
优点:操作简便,通气问题易解决,便于观察研究。
缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分充分利用,同时培养物排出的代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生毒害作用。
植物细胞按照分裂能力分三类
在细胞周期中运转的细胞,属周期细胞
暂时脱离细胞周期的细胞,它们可在适当的刺激下重新进入细胞周期,进行增殖。
属G0期细胞。
不可逆地脱离了细胞周期,失去分裂能力,保持生理机能的细胞,为终端化细胞. 实现细胞全能性的方法有:
1、以植物体细胞为材料,可以获得二倍体植株
可以开花、结果。
2、以植物性细胞如大小孢子体为材料,可以获得单倍体或其它倍性的植株。
3、以植物单细胞的原生质体或融合的原生质体为材料,可以获得不同倍性的植株,甚至自然中不存在的远缘杂种。
愈伤组织形成的过程
从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期:启动期(诱导期)、分裂期和形成期。
三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明
显的差别。
Stage 1. 诱导期(Induction):
诱导期是细胞准备分裂的时期,是愈伤组织形成起点。
特点:在诱导期,代谢活化了,细胞内蛋白质和RNA 含量迅速增加,细胞核体积明显增大。
细胞内的合成代谢迅速进行,但是细胞的大小仍然和外植体时一样,没有多大改变
一、呼吸作用加强,消耗氧气的量明显增加。
二、多聚核糖体的不断增加,到有丝分裂前
RNA的含量增加300﹪
三、蛋白质合成加快,分裂前细胞内蛋白质
的总量增加200﹪
四、各种与分裂有关的酶活性大加强。
Stage 2.分裂期(Cell division)
外植体中已分化的活细胞在外源激素的作用下,外植体外层细胞出现了分裂,由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小,逐渐回复到分生组织状态,因此也称为回复变化。
在回复变化时,细胞通过脱分化的启动期而进入分裂,并开始形成愈伤组织。
特征:是外层细胞进行分裂,而中间的细胞不分裂。
另外细胞数目增加,体积变小;细胞核和核仁增到最大,RNA含量升高等Stage 3.形成期(Differentiation)
特点:外植体细胞经过诱导期和分裂期形成了无序结构的愈伤组织。
进入形成期后,表层细胞分裂逐渐停止,内部深处细胞开始分裂,组织内部形成瘤状的拟分生组织。
形成愈伤组织形成中心或者进一步分化成为维管组织。
优良的愈伤组织:
1.具有旺盛的自我增殖能力;
2.容易散碎,以便建立优良的悬浮系或原生质体;
3. 高度的胚性或再分化能力;
4. 可以长期继代保存。
禾本科的愈伤组织类型:
保守分裂型:不易长时间保持胚性。
愈伤组织经过多次继代才获得胚胎发生--间接胚胎发生。
亢进分裂型:淡黄色或黄色,结构松散呈颗粒状,生长较快,能够长时间保持胚性。
在诱导培养基直接产生胚性愈伤组织和胚状体--直接胚胎发生
衰败型:结构疏松,生长缓慢,色泽暗淡
影响细胞脱分化因素
1.外植体本身损伤
2.生长调节剂
3.光照
4.细胞位置
5.外植体的生理状态
6.植物种类差异
7.基因型
外植体褐变
多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一类末端氧化酶,它催化酚类化合物形成醌和水,醌再经非酶促聚合形成深色物质,对植物体材料产生毒害作用。
褐变的影响因素:1、植物种类及基因型。
2、外植体的部位及生理状态。
3、外植体的受伤
程度。
4培养基的成分和培养条件。
5、培养时间过长
防止褐变的方法:
1、选择适宜的处植体
2、对外植体进行处理,如先进行低温处理,
再放入只含糖的琼脂培养基中,使酚类物质
渗入到培养基中。
3、选择适宜的培养基和培养条件
4、添加褐变抑制剂和吸附剂。
如维生素C等
5、连续转移。
减轻酚类化合物的毒害。
玻璃化现象:在进行植物组织培养时,经常会出现试管苗生长异常,叶等出现透明或半透明的水浸状植物矮小肿胀,失绿等现象称为
玻璃化现象。
原因复杂没有定论。
防止玻璃化措施:
1、增加琼脂浓度。
2、提高糖的含量或加入渗透剂,降低培养基中渗透势,减少植物材料可获得的水分。
3、降低培养基中细胞分裂素的含量
4、增加光照、控制温度、改善通风换气条件。
影响细胞再分化因素
关键:维管组织的分化(生长素、蔗糖浓度、细胞分裂素和赤霉素、物理因子)
不同种类植物的再生能力差异;
再生条件没有完全掌握;
影响因子与脱分化因子基本一致。
体细胞胚胎发生:双极性结构,与母体愈伤组织或外植体无维管束连接。
器官发生(也称茎芽分化):单极性结构,里面长出原形成层束,与原先存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接在一起
培养基成分:
矿质元素有机成分激素组合
环境条件:
光照温度湿度
植株材料:
品种基因型的差异
材料的生理状况
1)先生长素,后细胞分裂素,有利于细胞分裂,
但细胞不分化。
容易产生多倍体细胞。
2)先细胞分裂素,后生长素,细胞分裂也分化。
3)生长素和细胞分裂素同时处理,分化频率提高。
但两者同时存在的用量比值可以改变形态建成方向。
生长素/细胞分裂素:
比值高时,有利于根分化;
比值低时,有利于芽分化,抑制根形成;
比值适中时,促进愈伤组织生长。
培养基的渗透压
离体培养中培养基渗透压是影响植物细胞脱分化、再分化的重要因素。
培养基渗透压是由培养基中各种物质的总浓度决定的。
培养细胞是通过细胞渗透来吸取营养的,当培养材料和培养基之间处于等渗时,或培养材料的渗透压略低于培养基渗透压时,培养材料才可能汲取养分和水分。
培养基的酸碱度
胚胎发生:
受精作用触发卵细胞进行分裂并发育成胚,胚的发育过程称为胚胎发生。
体细胞胚与器官发生形成个体的途径相比:
一是体细胞胚具有双极性(doublepolarity),二是遗传的稳定性:胚状体起源于单细胞或细胞团,在产生和发育过程中一旦形成即通过了分化过程,结构即稳定,细胞变异的频率低,成苗率高,遗传稳定性好。
体细胞胚与合子胚的比较
胚柄、子叶、休眠
胚培养(Embryo Culture):是将胚从胚珠或种子中取出,置于适宜的培养基生长;包括未成熟胚和成熟胚两种类型的离体培养.胚培养的类型
成熟胚培养
成熟胚一般指从种子中剥离的发育完全的胚。
它培养容易成功,成熟胚材料不受季节性限制。
实质是胚的离体萌发过程
离体胚培养的发育方式:
1. 合子胚发育途径;由合子形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚,形成完整的种子,成苗
2. “胚”的早熟萌发;幼胚离体培养不是促进胚正常发育成熟形成幼苗,而是以幼小的胚的形态早熟萌发形成畸形苗。
苗的根、茎、叶俱全,但子叶中几乎无营养积累而极端瘦弱,在培养中适当调整培养基配方可以防止早熟萌发
3. 脱分化形成愈伤组织。
幼小的胚在离体培养时多数情况下脱分化形成愈伤组织。
主要原因为培养基中成分不适宜
幼胚培养方法
适宜于幼胚发育时期多为心形胚至鱼雷形胚
幼胚剥离是关键的关键
基本培养基:MS N6 White等
糖的作用:蔗糖是最好的碳源之一,调解渗透压主要作用
无机氮以硝酸盐、铵盐的形式存在可以提高钾和钙的浓度
氨基酸:谷氨酰胺刺激胚的生长;水解蛋白
维生素:促进幼胚的早期发育
天然有机物:胚乳看护培养
大麦离体胚,在含有同种胚乳的培养基中,对胚的生长促进。
大麦离体胚,在含有异种胚乳的培养基中,对胚的生长促进作用更强。
大麦×黑麦杂交胚,在含有大麦胚乳的培养基中,成苗率提高30-40%。
胚挽救(Embryo Rescue):是由于营养或生理原因造成难以播种成苗或在发育早期阶段就败育或退化的胚进行早期离体培养.
1、杂种幼胚在人工培养基上培养
2、杂种幼胚的胚乳看护培养
3、杂种幼胚的愈伤组织培养
胚的发育包括原胚时期-球型胚-心型胚-鱼雷胚-成熟胚。
胚发育可分为异养和自养两个阶段。
一般认为胚龄是影响胚培养成功的关键因素之一。
1、球型胚:成苗少,苗发育不良,缺叶绿素,子叶不发生。
2、心型胚:叶小白色,真叶发生需3-4周,后面的生长也不良。
3、鱼雷胚:叶绿色,展开的子叶大,苗发育较前两时期好。
胚培养的意义:
用于胚的挽救获得远缘杂种
打破种子休眠,缩短育种年限
诱导胚状体及胚性愈伤组织
种子生活力的快速测定
稀有植物的繁殖
克服珠心胚的干扰。
植物胚乳培养
含义:将胚乳组织从母体上分离出来,通过离体培
养,使其发育成完整植株的技术。
胚乳培养的最早研究始于1933年,Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。
(1)核型胚乳(2)细胞型胚乳(3)沼生目型胚乳
胚珠培养
含义:将胚珠从母体上分离出来,在人工控制下,进行离体培养,使其生长发育形成幼苗的技术。
类型:受精胚珠培养、未受精胚珠培养
子房培养
含义:将子房从母体上分离下来,置于培养基上,使其发育成幼苗的技术。
子房:由子房壁、胎座、胚珠组成
植物离体授粉
含义:在人工控制下将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来,进行无菌培养,并以一定的方式授以无菌花粉,使之在试管内实现受精的技术,也称试管受精,离体受精。
方法:离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉
细胞培养(cell culture ):将植物单细胞或细胞团直接在培养基中进行培养的一种方法。
优点:操作简便、重复性好、群体大等。
分类:1.根据规模:小规模培养、大批量培养;2.根据培养方式:悬浮培养、平板培养、看护培养、纸桥培养法;3.根据要求的产物:诱变的细胞培养、生产次生产物的细胞培养。