荧光原位杂交技术在自然流产或死胎中的应用

荧光原位杂交技术在自然流产或死胎中的应用
冯莉;周雪原;王晓华;冀小平;董弘;周燕;朱博;王紫横
【摘要】目的:利用荧光原位杂交技术(FISH)快速检测流产儿是否患有染色体疾病,为流产组织的遗传检测提供一种有效的检测方法.方法:选用13、18、21、X、Y无色探针对不明原因流产后的胎儿皮肤或绒毛等组织进行FISH检测.结果:26例标本中检测出异常染色体9例,异常率为34.6 %;其中45X 2例、46XX/46XY 1例、47XN+18 2例、47XXY 1例、47XN+21 2例、69XXY 1例.结论:荧光原位杂交技术可用于检测流产、死胎后的组织标本,为无法进行细胞培养核型分析的胎儿标本提供一种有效的检测方法.
【期刊名称】《包头医学院学报》
【年(卷),期】2013(029)002
【总页数】2页(P30-31)
【关键词】荧光原位杂交;自然流产;死胎;染色体疾病
【作者】冯莉;周雪原;王晓华;冀小平;董弘;周燕;朱博;王紫横
【作者单位】内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩特,010020;内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩特,010020;内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩
特,010020;内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩特,010020;内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩特,010020;内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩
特,010020;内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩特,010020;内蒙古妇幼保健院遗传科,内蒙古,呼和浩特,010020
【正文语种】中文
荧光原位杂交技术(flourescence in situ hybridization，FISH)是分子生物学与细胞遗传学相结合检测染色体异常的技术，是以荧光标记的染色体区带特异性DNA
为探针，与分裂期或间期细胞染色体进行原位杂交，于荧光显微镜下观察染色体畸变引起的形态与数目异常［1-3］。

目前妊娠结局中自然流产、死胎现象普遍增多，且大部分是由遗传因素引起，胎儿染色体疾病主要表现在第13号、第18号、第21号及X、Y染色体的数目与结构异常。

但是流产后的绒毛及胎儿组织标本由于
污染等原因，大部分不容易进行染色体培养核型分析。

因此利用FISH技术对这些标本进行检测，为临床提供一种可供选择的遗传病检测方法。

1 对象与方法
1.1 对象 2012年1月至2012年10月在本院流产的孕妇26例，取其胎儿绒毛及皮肤标本进行FISH检测，测定第13号、第18号、第21号及X、Y染色体数目。

1.2 方法
1.2.1 试剂染色体数目检测试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。

FISH检
测用第13号、第18号、第21号及X、Y所用的5种探针，其中13号染色体探针定位在13q14，21号染色体探针定位在21q22，18号染色体、X染色体、Y
染色体探针分别定位在着丝粒区域，其中GLP21/CSPX用四甲基罗丹明橘红色荧
光标记，GLP13/CSPY用异硫氰酸荧光素绿色荧光标记，CSP18用二乙基氨基香
豆素天蓝色荧光标记。

1.2.2 检测方法 (1)流产儿绒毛或皮肤细胞提取:取流产或死胎后已污染无法进行体
细胞培养的绒毛或皮肤组织，用眼科剪剪至糊状，加0.25%EDTA胰酶37℃水浴
消化30 min，加入含血清的普通羊水培养基终止消化，1 500 rpm离心10 min
后收集细胞进行FISH操作。

(2)绒毛或皮肤细胞FISH检测:①样本玻片制备:收集
已提取绒毛或皮肤细胞，加预热的0.075 M KCl溶液低渗，绒毛细胞低渗30 min，皮肤细胞低渗40～60 min;室温下预固定10 min，离心后固定3次，每次10 min;制备2～3张玻片，75℃烤箱老化玻片60 min。

②玻片预处理:室温下用
2×SSC漂洗玻片2次，每次5 min;室温0.1 M HCl中浸泡10 min;用37℃装有6 μg胃蛋白酶的40 mL 0.01 M HCl溶液浸泡玻片10 min，室温下用2×SSC漂洗玻片2次，每次5 min;-20℃预冷，在70%、85%乙醇中各浸泡2 min，无水乙
醇浸泡10 min，自然干燥;加热玻片至56℃。

③标本杂交:73℃变性液浸泡玻片8 min进行变性处理，分别置于预冷的70%、85%、100%乙醇处理3 min，自然
干燥，加热至47℃，将杂交缓冲液、去离子水、探针按7∶1∶2比例配好后加入
离心管，73℃水浴锅变性5 min;变性后的杂交探针滴于玻片上，盖盖玻片，在湿
盒中37℃过夜。

④标本洗涤:避光条件下移去盖玻片，47℃洗液洗3次，每次5 min;47℃ 2×SSC浸泡10 min;47℃ 0.1%NP-40浸泡5 min;室温下70%乙醇浸
泡10 min，自然晾干;滴加适量DAPI荧光染料。

⑤镜检:荧光显微镜下，100×油
镜观察染色体荧光信号。

1.2.3 诊断标准每例样本计数100个细胞，90%以上的细胞正常提示为正常结果，90%以上的细胞异常提示为异常结果，如果无法判断则扩大计数至200个细胞。

2 结果
在26例中，检测出异常结果9例，异常率34.6%，其中45X 2例、46XX/46XY
1例、47XN+18 2例、47XXY 1例、47XN+21 2例，69XXY 1例。

详见表1。

表1 26例染色体数目异常率标本类型标本总数异常染色体数异常染色体率(%)20 7 35.0皮肤 6 2 33.3合计绒毛26 9 34.6
3 讨论
目前妊娠结局中自然流产、死胎现象普遍增多，且大部分是由遗传因素引起，胎儿染色体疾病主要表现在第13号、第18号、第21号及X、Y染色体数目异常与结
构异常［4］，本研究通过13q14、21q22基因片段荧光标记和着丝粒荧光标记
检测探讨流产儿或死胎儿发病原因，为下一次妊娠提供更全面的参考数据。

孕妇流产后的绒毛或皮肤等标本由于胚胎停止发育而使细胞失去活性、取材不当导致标本被污染等原因，导致这些标本很难培养成功。

利用荧光原位杂交技术对这些标本进行检测，可以弥补传统核型分析需要活细胞培养的严格条件。

同时FISH检测还有检测时间短、方法简单，对标本质量要求低、受外界影响因素少等优点［5］。

在本次检测的26例自然流产或死胎后的绒毛皮肤标本中，检测出5种染色体异常9例(34.6%)，说明在流产的原因中有30%以上是由于胚胎的染色体数目异常所致，属于染色体数目异常后母体对胚胎的自然淘汰，比以往报道的早孕期流产50%为
染色体数目异常要少，原因可能是:(1)由于在以往的报道中，标本的检测主要以细
胞培养的方法为主，可以检测所有的染色体数目异常，而我们只检测了5种染色
体数目异常，所以会有一部分漏检。

(2)我们检测的标本中皮肤标本主要是大月份
的死胎标本，大月份死胎原因染色体数目异常率较低。

(3)我们检测样本量较少。

需要进一步扩大样本量，探索自然流产胎儿染色体异常患病率与孕妇年龄、孕周、流产次数等其他因素之间的关系。

本研究通过对流产组织标本的FISH检测，为这些孕妇的流产原因寻找一种方便可行的判断方法，为孕妇的下次妊娠提供可靠的遗传咨询信息。

参考文献
［1］宋婕萍，王波，徐淑琴，等.荧光原位杂交技术在胎儿染色体非整倍体产前诊断中的应用［J］.实用医学杂志，2012，28(1):111-113.
［2］辛毅，潘晓冬，刘晴，等.荧光原位杂交技术产前诊断先天性心脏病22q11.2微缺失应用价值［J］.心肺血管病杂志，2012，31(3):236-240.
［3］潘承双，邱秀芳，黄锡玺，等.精子荧光原位杂交分析男性臂间倒位携带者的
减数分裂结果［J］.中华男科学杂志，2012，18(4):344-348.
［4］崔婉婷，李婷婷，刘彩霞，等.应用荧光原位杂交技术检测自然流产组织染色体数目异常［J］.中国优生与遗传，2012，20(5):48-50.
［5］秦爽，肖青，钟卓慧，等.荧光原位杂交技术检测130例自然流产绒毛染色体结果的观察与分析［J］.中华临床医师杂志，2012，6(13):3729-3731.。