玻璃化冷冻度

玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。

各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。

人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。

玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。

解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。

C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)
当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。

比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。

冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。

这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。

玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。

冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透
到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。

玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。

冷冻管和DAP213在0℃下预处理，冷冻条(用于盛装冷冻管)在液氮罐中预冷，提高了玻璃化冷却速度，快速通过危险的温度区域(15--5℃)以降低冷冻损伤，显著提高胚胎存活率。

玻璃化冷冻过程中，冷冻和解冻的速率是影响玻璃化胚胎成活率的关键。

冷冻解冻速率快，不易形成冰晶。

复苏时使用，含0.25 M蔗糖的PBs,解冻液，使得跨膜物质浓度和渗透压差别不大，细胞膜不易损伤。

其中的蔗糖起到渗透缓冲的作用，防止水分大量渗入胚胎细胞引起过分膨胀，以降低由于冷冻保护剂的稀释导致渗透休克的形成.
玻璃化冷冻是指溶液在极低的温度(一196 c)下变为不含任何内部冰晶的固态，可以避免在细胞内形成冰晶，降低低温对细胞产生的损伤[n所以玻璃化冷冻法自发明以来便成为低温生物学领域的研究热点.但玻璃化冷冻法存在的问题是高浓度玻璃化冷冻液不可避免地会对卵母细胞造成化学毒性损伤和渗透压损伤。

因此，通过加快冷冻一解冻速度，缩短卵母细胞与玻璃化溶液的接触时间，以降低其化学毒性和渗透压损伤.尽管如此，玻璃化冷冻保存卵母细胞因结果重复性较差。

二甲基亚讽(DMSO)的玻璃化形成能力相对较好，对细胞渗透很快、毒性较低。

甘油和乙二醉(EG)的毒性较小，但玻璃化形成能力稍差.1,2丙二醇(PROH)的玻璃化形成能力较好，但浓度超过10%时毒性很大，将其以适当浓度加人其他低温保
护剂，可以增强玻璃化形成能力而没有毒性效应，是较好的玻璃化增强剂
冷冻保护剂的种类影响卵母细胞的冷冻效果，而且浓度也是非常关键的因素。

浓度过低，所形成的玻璃化状态不稳定，浓度过高，对细胞的毒性太大。

冷冻损伤
冷冻过程中造成卵母细胞超微结构的损伤是目前研究中t待解决的问题，这些超微结构主要包括细胞膜、微丝、微管、皮质颗粒、纺锤体和线粒体等。

它们制约着卵母细胞玻璃化冷冻技术的发展。

因为超微结构的损伤直接影响卵母细胞的受精率和胚胎的发育水平。

4.1 细胞膜
在冷冻解冻过程中，质膜和微绒毛的破坏是主要的损伤。

在程序冷冻时，平衡过程中由于渗透压的差异，水及冷冻保护剂快速通过质膜、冷冻解冻过程中细胞内冰晶的形成、稀释过程中细胞过度膨胀以及冷冻保护剂与细胞直接相互作用(如离子泵崩解)等都可引起细胞膜的破坏。

玻璃化溶液的化学毒性也可以引起质膜的结构破坏。

4.2 皮质颗粒
Ma ry 等 (1989)报道，用冷冻保护剂DMSO和PROH处理人和小鼠的成熟卯母细胞后，电镜观察皮质区皮质颗粒显著减少，尤其是位于纺锤体上方的区域皮质颗粒减少的数目更加显著，只有对照组的20 。

几乎100%的处理卵母细胞中都能观察到皮质颗粒的提前胞吐现象。

冷冻解冻后卵母细胞受精率普遍下降，很可能与皮质颗粒的提前胞吐从而造成透明带硬化而引起的。

所以.很可能是由于DMSO和PROH通过刺激人和小鼠卵母细胞内Cat+的瞬时增加而导致皮质颗粒的胞吐。

4.3 线粒体
刘海军等 (2001)用OPS法冷冻山羊卵母细胞后观察到GV期卵母细胞线粒体有的发生损伤，主要表现在晴不清楚或扩张，培养9h和IVM卵母细胞的线粒体基本上保持正常结构[f"3. Noto等(1993)报道，线粒体分布的紊乱发生于冷冻保存后的一个特殊的细胞阶段[201 线粒体在胞质中的运动往往与微管有关.因此，很可能是由于冷冻所造成的微管损伤从而使线粒体的分布发生紊乱。

4.4 微丝、微管
微管是发育的卵母细胞成熟所必需的，将引导决定染色体如何分布.微管具有对环境条件及理化因子作出反应而迅速聚合和解聚的惊人能力，温度是微管动力学最敏感的因子之一。

由冷冻损伤而引起的任何细胞骨架畸形都将对解冻后卵母细胞的进一步发育造成影响Czp
4.5 纺锤体
Am an 等 (1994)研究了冷冻及解冻对牛体外成熟卵母细胞纺锤体的影响，结果表明，将卵母细胞置于4'C 60min，与置于39℃的对照组相比，纺锤体形
态明显变化，或退化或完全缺乏;而将卵母细胞置于25"C 30min后，只有7%的卵母细胞含有正常的纺锤体。

将卵母细胞置于4℃或25℃各30min，再于39 'C孵育
30min后，与对照组卵母细胞相比，纺锤体都没有恢复到正常形状[22)。

说明低温影响纺锤体的组装以及功能的实施。

以上结果表明，超微结构的损伤可能不是孤立的。

微丝、微管受到损伤可能影响到线粒体的分布，并直接影响到纺锤体的恢复，进而影响染色体的分布。

这一系列变化都将影响卵母细胞以及胚胎的发育能力。

二甲基亚矾、乙二醇、甘油是冷冻卵母细胞最常用的并且经过实践证明冷冻效果也较好的渗透性冷冻保护剂，一般为小分子物质，通常通过细胞膜进入细胞，作为细胞内液抗冻剂。

其作用机制是与水结合后，使溶液冰点下降，不易形成冰晶。

作为冷冻保护剂各有特点，乙二醇较二甲基亚矾的细胞毒性小，但其渗透性较二甲基亚矾弱。

而甘油的分子量低、毒性小、渗透性差但粘性大，很容易形成玻璃化，不过甘油太低的膜通透性成为甘油作为冷冻保护剂最大的弱点，所以目前无论是慢速冷冻还是玻璃化冷冻都很少单独使用甘油作为冷冻保护剂。

目前常用的渗透性保护剂是乙二醇或联合使用DMSO，非渗透性保护剂有蔗糖、海藻糖等现在逐渐用膜通透性更高、毒性更低的乙二醇代替DMSO作为渗透性保护剂。

使用蔗糖作为非渗透性保护剂，适当提高蔗糖的浓度或者在冷冻液和融解液中使用不同的蔗糖浓度均可以提高冻融卵母细胞的存活率和种植率。

细胞内保护剂，其作用机制主要是将细胞膜由相对液态变成相对坚硬的固态;非渗透性保护剂因为分子大而不能穿透细胞膜，称细胞外保护剂，主要是通过提高细胞外液的浓度而产生跨膜的渗透压梯度，将水分从细胞内吸出，使细胞脱水发挥非特异性保护作用。

玻璃化冷冻中含高浓度的冷冻保护剂，所以复温后必须迅速洗脱冷冻保护剂，但因为水分子小，远比保护剂进出细胞快，因此面临渗透损伤包括渗透肿胀和皱缩。

PROH的毒性较小，玻璃化的趋势更大;EG分子质量较小，对细胞膜的通透性较强，化学毒性较小，但玻璃化形成的状态稍差些;DMSO分子较大，通透性较EG 差，化学毒性较大，对细胞骨架的损伤特别明显，但形成玻璃化状态好些，同时DMSO对卵细胞和胚胎的毒性是与暴露过程中持续时间的温度相关的，表现为较低温度下应用DMSO具有较好结果。

因此应用两种抗冻剂混合后既提高了抗冻剂的渗
透
性，又缓解了DMSO的化学毒性，玻璃化状态形成比较彻底。

所以一般实验采用EG 加DMSO作为冷冻保护剂
0.1mol/L蔗糖浓度不能使卵母细胞降温前充分脱水，而两倍或三倍蔗糖浓度可
大大提高卵母细胞存活率，但0.3 mol/L蔗糖浓度可能会导致细胞内水分的过度丢失而引起细胞膜塌陷。

蔗糖做为一种冷冻添加剂亦常规用于玻璃化冷冻方案中，其能够稳定细胞膜的结构，有助于细胞的脱水，蔗糖的加人可以减少渗透性保护剂的用量，除此，还具有中和毒性的作用。

大分子聚合物在冷冻过程中能够发挥渗透作用，促使细胞外玻璃化的形成，又可在细胞表面形成一层戮性保护膜，减少冷冻损伤。

玻璃化冷冻液中含有高浓度的渗透性抗冻剂，在平衡过程中，高浓度的抗冻剂大量渗入胚胎细胞内，同时，细胞内水分也大量渗出。

由于细胞内抗冻剂浓度很高，水分很少，是一种高粘稠的玻璃态物质，在低温时不发生结晶就可以固化而成为均匀的玻璃化状态，此固态物质能保持液态时正常的分子和离子分布，这样就避免了常规冷冻过程中形成冰晶而损伤细胞膜和细胞骨架的现象发生。

慢速冷冻是目前普遍使用的方法，它主要通过低温保护剂渗透进入胚胎或卵母细胞内部，使之脱水，再投入液氮中达到长期保存的目的。

如果降低保存液冰点，并且在稍低于冰点的温度下植冰，就能缓和细胞内冰晶的形成。

植冰就是在略低于溶液冰点温度时强制性地促使细胞外液形成冰晶的过程。

经过植冰而使细胞外保存液也因形成冰晶而发生浓缩，细胞内则处于相对低渗状态，为平衡渗透压，细胞内水分渗出到细胞外形成冰晶，结果使细胞内液也不断浓缩，以致细胞内不易发生冰晶而是形成玻璃化状态。

这个过程中缓慢降温是非常重要的，如果降温太快，细胞内水分来不及外渗，就会在细胞内形成冰晶，损伤细胞。

但是，在缓慢降温过程中，由于保存液的浓缩而常发生细胞的盐离子损伤。

此外，随着细胞
外冰晶的生成，细胞在浓缩液中所存在的空间减少，最终也会出现因受冰晶挤压而发生的机械损害。

玻璃化就是在溶液的粘性很高的情况下，在特定温度时形成非结晶的固态。

胚胎玻璃化冷冻则是将胚胎置于含有高浓度抗冻保护剂的溶液中，在。

℃以上的温度下，直接投入液氮(-1960C)。

在这个急速降温的过程中，液体的粘度增加，当粘度达到临界值时变成固态，即玻璃化.
高浓度渗透性抗冻保护剂可以通过细胞膜渗透，短时间内使细胞内、外抗冻保护剂的浓度达到平衡，使降温过程中细胞内冰晶的生成受到抑制。

因此，胚胎在高渗透压液、急速降温时易形成玻璃化态的溶液中平衡后，直接投入液氮中，细胞内、外都形成玻璃化而得以长期存活。

本试验比较了卵母细胞在低温(4℃)、室温(25℃)和生理温度(38.℃)下平衡对冷冻效果的影响，结果表明，25℃和38℃无显著差异，而4℃中平衡大大降低了冷冻效果。

先用10%E+10%D处理，后在玻璃化溶液中平衡，EG和DMSO能充分渗透到胚胎细胞内，同时细胞内水分能最佳脱出，冷冻时形成玻璃化较好;(2)解冻时，在0. 5 mol/L蔗糖溶液中平衡5min,EG 和DMS()能充分渗出，对胚胎的化学毒性和稀释过程中的渗透膨胀降低到最低
胚胎解冻液为0. 5 mol/1.蔗糖
0. 5 mol/1蔗糖平衡($)*时，囊胚发育率低，+种解冻方法均,$)*时，囊胚发育率和孵化囊胚率最高，当继续延长到-$)*以后，胚胎发育率开始下
降。

可能原因为：蔗糖溶液在稀释细胞内保护剂时起缓冲渗透压的作用，维持了细胞外液较高的渗透压，使细胞内保护剂渗出的同时，控制细胞外水分渗入的速度和渗入量，从而防止因水分的迅速渗入而导致细胞过度膨胀，减少细胞渗透性休克和细胞破裂现象的发生。

目前比较常用的渗透性冷冻保护剂有+B,C、:EF 等，其保护作用机理
非常复杂，主要有3种途径：1.可降低溶液的冰点；2.在冷冻过程中
参与细胞膜的修饰；3.可防止卵母细胞暴露于高浓度的电解质溶液
中。

冷冻保护剂对于卵母细胞玻璃化冷冻保存具有非常重要的作用。

根据其对细胞膜的通透性不同，可将其分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂两类。

渗透性保护剂为一类小分子化合物，可以穿透细胞膜进人胞质，故又称为细胞内保护剂，主要有二甲基亚矾(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PROH )和甘油(GL)等，主要的作用机制是与水结合后，使水的冰点下降，不易形成冰晶，从而起到冷冻保护作用。

非渗透性保护剂是一类分子量较大的化合物，它们无法穿透细胞膜进人胞质，因而作为细胞外液保护剂，主要有蔗糖、聚蔗糖、聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)等，其作用是通过提高细胞外液渗透压，使细胞内的
水分充分外流。

因此，在冷冻过程中，也减少了冰晶的形成，达到了冷冻保护的目的。

冷冻保护剂的毒性作用用玻璃化冷冻方法冷冻卵母细胞，虽然避免了冰晶对卵母细胞的损伤，但组成玻璃化液的高浓度的渗透性冷冻保护剂本身具有毒性，会对卵母细胞造成一定程度的伤害。

因此必需采用一定的方法以减小对卵母细胞的损害，其主要方法有选用低毒性的冷冻保护剂、缩短卵母细胞与冷冻保护剂的接触时间、降低冷冻保护剂的温度和对某些冷冻保护剂选用特定的毒性中和剂(如在DMSO中加人适量的甲酞胺或乙酸胺)。

目前，在猪卵母细胞中尚未见有用毒性中和剂减小冷冻保护剂毒性的报道。

由于猪卵母细胞对温度比较敏感，GV期卵母细胞在15%以下不易存活，但温度越高冷冻保护剂的毒性越大，考虑这两个方面因素，加上为了操作的方便，实际操作常采用室温下进行。

高浓度冷冻保护剂对卵母细胞的毒性与两者的接触时间有关，接触时间越长，毒性越大。

因此，应尽量减少与高浓度冷冻保护剂的接触时间。

但时间过短，渗透性冷冻保护剂不能充分地透过细胞膜进入细胞内，会影响玻璃化冷冻效果。

为了解决这一矛盾，可以在卵母细胞放人高浓度冷冻保护剂之前，先放人浓度较低的冷冻保护液中平衡一段时间，即采用逐步玻璃化冷冻的方法，将卵母细胞分步骤放人浓度逐渐升高的冷冻保护剂中，然后投人液氮中保存。

有研究者将猪GV 期卵母细胞逐步和一步放入含EG的培养液中一段时间，再逐步和一步移出EG，不经冷冻直接体外成熟培养。

结果表明，采用逐步法获得达MI期的比率最高为90%, 而一步法最高为50%。

使用逐步冷冻法玻璃化冷冻猪卵母细胞，可使解冻后发育到mn期的比率从5.6%提高到22%151，直接证实了逐步玻璃化冷冻的效果。

采用这一方法能产生较好的效果，除了由于减少与高浓度冷冻保护剂的接触时间外，还由于可以减少高浓度冷冻保护剂快速进人细胞内引起的细胞内外渗透压差过大对细胞造成的损伤。

因此在玻璃化冷冻保存细胞、组织的过程中常采用逐步加载、移出冷冻保护剂的方法，以减少细胞内外的渗透压差。

细胞骨架稳定剂的影响
细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。

它在维持细胞形态，保持细胞内部的有序性中有重要作用，并与细胞分裂、细胞分化、细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和基因表达等生命活动密切相关。

因此，细胞骨架的破坏会
严重影响细胞的发育低温冷冻保存猪卵母细胞会扰乱细胞的微丝和微管等的有序结构，对细胞骨架造成损伤。

为了避免这一损伤，可采用骨架稳定剂使细胞骨架稳定以提高冷冻效果。

有研究表明，猪GV期卵母细胞在玻璃化冷冻前用7wg/ml 细胞松驰素B(CB)预处理，解冻后体外培养，其发育至MI期的比率可从5.6%提高到22% [s]。

另有报道，分别用2.5ug /m1,5. 0 ug /m1,和7.5 ug /m1 CB处理GV 期猪卵母细胞30min，染色后相差显微镜下观察核成熟率，结果分别20.0%,30.7%和46.8%。

这说明CB的加入可提高猪卵母细胞玻璃化冷冻效果，而且CB量的不同对实验结果有较大影响，CB的最优量尚待进一步摸索。

以上实验结果说明，CB作为一种细胞骨架稳定剂，可提高猪卵母细胞玻璃化冷冻效果，这可能是因为它是一种微丝抑制因子，可结合在微丝的末端阻止肌动蛋白的聚合，在很大程度上抑制了细胞浆的移动，却不会影响细胞的有丝分裂。

因此，加人CB可降低猪卵母细胞对冷冻的敏感性，有效减少了冷冻过程中高浓度冷冻保护剂对卵母细胞的损伤。

目前，CB已广泛的运用于猪卵母细胞的玻璃化冷冻保存中。

高浓冷冻保护剂和低温会对配子、胚胎及卵巢组织造成化学和物理损伤。

化学损伤是指冷冻保护剂的细胞毒性作用;物理损伤是指细胞内水份在降温时形成冰晶对细胞膜、细胞器的机械性损伤，以及降温、复温时细胞内外渗透压改变而造成的渗透性损伤。

22.5%甘油加22.5%PROH 16步法和10%甘油加20% PROH 2步法玻璃化冻融牛囊胚，发现所有囊胚腔内均未见冰晶形成，均完全玻璃化，但16步法平衡囊胚质膜上只有轻微超微结构改变，而2步法平衡囊胚上有多处小囊形成和明显微粒外膜聚集。

Ohhoshi等研究也发现，将孵育后囊胚直接投入玻璃化冷冻液(1步法)可产生微粒丢失，细胞质膜破裂，线粒体改变，胞质内网状组织肿胀，但细胞核及其连接结构未受到损害。

将孵育后胚胎放人10%EG中平衡5min再投入玻璃化冷冻液(2步法)比1步法产生的损伤更小，且经2步法冻融体外孵育18h后存活胚胎中，有些胚胎结构重新恢复到原来的状态，有些胚胎出现严重的损伤，不能重建囊胚腔结构。

这表明玻璃化冷冻能损伤牛胚胎细胞膜结构，且损伤程度和性质依赖于玻璃化冷
冻步骤。

玻璃化冷冻可使胞质酶丢失，虽然没有整个细胞溶解。

冷冻保护剂中(3.2m ol/LE G,2.3 6m ol/LDMSO,0.6 m ol/L蔗糖)。

渗透性CPA以的作用是通过降低冰点，取代细胞内蛋白、DNA和其他成分周围的水分，减少或避免细胞内冰晶形成。

非渗透性CPA有利于改善保护液的玻璃化性质，提高冷冻保护效果，也能够通过渗透效应促进细胞脱水，稳定细胞膜，降低达到玻璃化本身所需要的CPA的用量，从而减小玻璃化溶液的毒性。

大量研究证实，玻璃化冷冻液中添加多种渗透性CPA (如EG和DMSO)，以及不同类型和比例的非渗透性CPA(如蔗糖、聚蔗糖等)对细胞和组织进行玻璃化冻存的效果更好，对其解冻后的形态和存活率无影响。

一般情况下，玻璃化溶液中含有的渗透性CPA 浓度大于30%，非渗透性CPA蔗糖浓度通常在0.1一lmol/L. EG是人胚胎、受精卵、卵母细胞玻璃化冷冻最有效的低毒性CPA，冻融后存活率高，但与冷冻对象的接触时间不能过长(<2min)，温度不能过高(<25℃)。

目前，多数研究者都是将15%EG，15%DMSO添加
0.6mol/L蔗糖作为一种相对稳定的冷冻溶液，在降低毒性的同时也减少细胞因冻融过程发生过度缩水、膨胀的现象，使细胞在此环境耐受能力增强，存活率提高。

卵母细胞与DMSO的接触时间过长(5min，37℃)会导致卵母细胞自发激活，诱发孤雌生殖;短时间作用(lmin，室温)则会得到较高的卵母细胞成熟率并不会诱发孤雌生殖.
(20%EG，20%DMSO，0.75mol/L蔗糖)，GV期卵母细胞解冻后存活率较
高，体外培养成熟率可达到85%左右。

冻：室温下将卵子在Sl中冲洗2～3次后移人10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)(s2)中停留30s后移入20％EG+20％DMSO+O．5M糖(S3)中，立即投入液氮。