香蕉中多酚氧化酶性质及褐变控制

香蕉中多酚氧化酶性质及褐变控制
柳素洁;杜金华;单玲克;刘伟
【摘要】对香蕉果肉中多酚氧化酶（PPO）的最适温度、最适pH值以及热稳定
性等性质进行了研究。

结果表明：香蕉PPO的最适温度为30℃，最适pH值为6．5。

80℃水浴处理10min后酶活力下降了50％，90℃水浴处理10min酶的失活率达到90％。

实验中还考察了柠檬酸、抗坏血酸（Vc）、二氧化硫（SO2）对PPO的酶活抑制效果，结果显示：当V。

添加范围在0．1—0．5g／kg时，对PPO酶活力的抑制率达到97．5％-98．35％，其次是SO2，在添加范围内抑制
率可达11．85％-16．77％，而柠檬酸在可添加范围内对PPO的抑制效果基本可以忽略。

最后选取SO2、Vc酶处理pH值及处理时间4个因素进行中心组合设计，利用二次响应面分析对组合的抑制效果进行优化研究，结果表明：SO2浓度为0．12g／kg，Vc浓度为0．2g／kg，pH值为3．83，处理时间为12．6h，此时组合对酶的活性抑制效果最好，酶活力抑制率达到96．98％。

【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2012(038)002
【总页数】5页(P126-130)
【关键词】香蕉;多酚氧化酶;响应面分析;失活
【作者】柳素洁;杜金华;单玲克;刘伟
【作者单位】山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安271018;山东农业大学
食品科学与工程学院,山东泰安271018;山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰
安271018;山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安271018
【正文语种】中文
【中图分类】TS255.3
香蕉富含碳水化合物、β-胡萝卜素、钾钙等矿物质和多巴胺，是全世界最重要的
食物资源之一［1］。

近年来，香蕉产业链不断发展扩大，但香蕉加工相对落后，究其原因，主要是因为去皮后的香蕉果肉会迅速褐变。

国内外学者一致认为果蔬的酶促褐变，主要是由多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)在有氧条件下将酚
类物质氧化为醌，醌再进一步脱水、聚合，最后形成褐色物质的过程。

PPO是发
生酶促褐变的主要酶，存在于大多数果蔬中。

在大多数情况下，由于PPO的作用，不仅严重损害果蔬产品的感官品质和市场价值［2－3］，还对产品的营养价值有
着极大的破坏作用［4］。

抑制酶促褐变的方法较多。

物理方法如烫漂，导致果蔬质地变软影响其品质［5－6］。

Koffi等人研究发现虽然热处理能够很好地抑制酶促褐变，但是严重的影响
了果汁的风味［7］。

超滤、超声处理、超临界二氧化碳处理也用来钝化多酚氧化酶，但超滤只能用于液体，而后两者又需十分复杂的设备，物理方法显然有局限性。

而化学方法一直是食品工业中最为广泛地用来抑制褐变的方法。

付聿成［8］等研究了用ClO2处理抑制金帅苹果中的PPO，ClO2的浓度与PPO活力呈负相关。

为深入研究香蕉抗褐变技术措施，探讨香蕉中PPO酶学特性，本文对香蕉中PPO 酶活特性进行研究，对几种常用防褐抑制剂对香蕉PPO的抑制效果及贮运品质的影响进行试验筛选，并分析了其复合抑制效果及其抑制条件。

以期为香蕉加工中褐变控制提供理论和实践依据。

1.1 实验原料
巴西蕉 (Musa AAA Cavendish cv Baxi)，市售。

1.2 主要试剂及仪器
PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)，邻苯二酚，Na2HPO4，柠檬酸，SO2，VC，FE20 pH 计，紫外可见分光光度计(UV-2100型)，高速台式离心机(TGL-16G)。

2.1 粗酶液的提取
参照Rocha的方法［9］，准确称取香蕉果肉20 g置于研钵中(预冷)，迅速加入含有PVPP和磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH6.8，预冷)，在冰浴中迅速研磨成浆，过滤，于12 000 r/min离心10 min，收集上清液，即为粗酶液，在4℃下保存备用。

2.2 多酚氧化酶活力测定
迅速将磷酸盐缓冲液(pH6.8)2.0 mL、0.2 mol/L邻苯二酚0.8 mL和0.2 mL PPO 粗酶液混匀，在412 nm波长处比色测定，空白对照中不含粗酶液。

酶液加入后开始计时，每30s记录1次吸光度A随时间的变化值，以10 min内最初直线段的斜率(△A/t)计算酶活力。

1个酶活力单位为:在此测定条件下每分钟A值改变0.001所需要的酶量［units/(min·g)］。

2.3 香蕉PPO酶活性质研究
在pH值为3.0～7.5的一系列磷酸盐缓冲液(每0.5为1个梯度)，分别加入相应pH值的底物(0.2 mol/L)和PPO粗酶液，在15℃下混匀反应，按2.2的方法测量酶活力的最适pH值。

每组试验重复3次，取其平均值。

PPO的最适温度在温度范围为15～55℃(每5℃为1个温度梯度)进行测定，基质溶液(包括磷酸缓冲液和邻苯二酚)分别水浴升温至指定温度，加入粗酶液在该温度下反应，按2.2的方法在找出的酶活的最适宜温度。

PPO的热稳定性在温度范围为60～100℃进行测定。

取磷酸缓冲液和粗酶液置于60～100℃的水浴中10 min，取出后立即置于冰浴中冷却至室温，加入底物计时反应，在波长412 nm测定酶活力。

另取没有水浴的样品作对照反应，抑制率计算:
2.4 单因素试验
选取柠檬酸(1～5 g/kg)，SO2(0.01～0.15 g/kg)，VC(0.1～0.5 g/kg)作为酶活抑制剂，分别添加到基质溶液中，根据前文提到的方法分别测定PPO酶活力。

抑制率按照公式⑴来计算。

PPO粗酶液分别用SO2(0.12 g/kg)和VC(0.2 g/kg)处理，在15℃下放置24 h，每2 h测定1次酶活力(试验所选剂量为上步试验中的最佳用量)。

取粗酶液用
SO2(0.12 g/kg)和VC(0.2 g/kg)的混合溶液进行处理，在8～18 h之间每2 h测量1次酶活力。

抑制率按照公式⑴来计算。

选取处理pH值范围在3.5～4.5，每0.1个pH作为1个梯度。

在指定的pH的缓冲液中加入PPO粗酶液，于15℃下放置12 h后，加入底物邻苯二酚测定酶活力。

底物的pH值与缓冲液的pH值相对应。

2.5 响应面法优化4个单因素
以单因素优化结果为基础，确定了 SO2浓度0.12 g/kg、VC 浓度0.2 g/kg、pH 值4.0、处理时间 12 h为拟合中心组合。

用SAS软件根据Box-Behnken组合设
计原理，设计4因素3水平的响应面分析试验。

因素水平编码表如表1所示。

2.6 数据分析
用SAS软件对中心组合设计结果进行统计分析，试验结果均为3次结果的平均值。

图中每个点都是3次结果的平均值，差异性由Dps软件进行分析，采用Turkey
法进行多重比较，其中不同的字母表示差异显著，小写字母表示P＜0.05，大写字母表示P＜0.01。

3.1 香蕉PPO酶活特性研究
如图1，香蕉PPO有2个酶活力顶点，最高酶活力顶点在pH6.5。

而Chitsuda ［10］等人研究发现，用多巴胺作底物时香蕉PPO酶活力的最适pH值在7.0。

可以看出，香蕉PPO的最适pH值应该受其反应底物的影响。

第2高活力顶点在
pH5.5，这可能是由于同工酶的存在，目前已经发现香蕉中含有1个具有多种同工酶的酶系统［7］。

当pH＜5.5时，酶活力显著受到抑制。

在pH5.5～4.5，酶活
力下降斜率V2达到251.10，而 pH4.5～3.0的酶活力下降斜率 V1为111.96，
远远小于前者(P＜0.01)。

当pH为6.5～7.5时，酶活力下降斜率V3为74.60，
V3与V1之间没有显著性差异(P＞0.01)，而与V2差异显著(P＜0.01)。

这说明，如果在香蕉加工过程中处理pH值能够低于4.5，能够显著抑制香蕉中PPO的酶
活力，从而减轻加工过程中的褐变程度。

如图2所示，以邻苯二酚作为反应底物，香蕉PPO酶活力最高顶点在30℃，同
样的，香蕉的最适温度也受到反应底物的影响［12］。

从15～30℃，PPO的酶
活力随着温度的提高逐步增加(P＜0.05)，这表明适当的温度能够提高酶促反应。

从30～55℃，PPO的酶活力随着温度的提高有下降的趋势(P＜0.05)。

这可能是
由于较高温度下，PPO发生变性、结构变化或者可能是在反应过程中氧气消耗的
缘故。

温度对多酚氧化酶的影响是双重的，一方面温度升高能加快酶催化反应速度进程，另一方面促使酶蛋白变性，是2种对抗效应综合反应。

由图3可知，随着温度的
升高，PPO的酶活抑制率增加。

在60℃时，PPO酶活抑制率为23.95%。

从
60～75℃抑制率上升较缓慢。

当温度达到80℃时，酶活抑制率达到50.34%，比60℃的抑制率高提高了一倍。

温度达到90℃时，抑制率急剧提高，高达91.73%。

当温度达到100℃时，PPO几乎完全失活，抑制率达到99.46%。

3.2 单因素试验
3.2.1 抑制剂及其浓度对PPO酶活力的影响
3种抑制剂及其浓度对PPO酶活力的影响如表2所示。

表2中所选浓度范围皆满足食品添加剂或食品加工的要求。

其中，VC对PPO酶活力具有最好的抑制效果，其次是SO2。

而在所选浓度范围下，柠檬酸对PPO的酶活抑制效果较弱。

如表2
所示，当SO2的浓度为0.10和0.11 g/kg时，对PPO的酶活抑制率仅有11.85%和12.56%，且两者之间没有显著性差异(P ＞0.05)。

而浓度为 0.12 ～0.15 g/kg 时，抑制率达到16%以上，且相对于前者有显著性差异。

而0.12和0.15 g/kg的浓度之间没有显著性差异。

因而0.12g/kg被选为SO2的最适宜抑制浓度。

由表2可知，VC的有效抑制浓度为0.2 g/kg，当VC添加量为0.1 g/kg时，抑
制率最低为97.50%。

在添加量为0.3 g/kg时具有最高抑制率98.35%。

但其与其余几个浓度添加量之间没有显著性差异。

柠檬酸在所选浓度范围内抑制效果很小，当添加浓度为1和2 g/kg时，抑制率仅仅为1.07%和1.21%，且它们之间没有显著性差异(P＞0.05)。

当添加浓度达到3 g/kg，抑制率可以达到7.21%，与添加量为1和2 g/kg的抑制率之间差异显著(P＜0.05)，但与添加量为4和5 g/kg的抑制率之间没有显著性差异。

因而，最终选取0.12 g/kg的SO2和0.2 g/kg VC作为最优单因素。

3.2.2 处理时间对抑制率的影响
用0.12 g/kg的SO2和0.2 g/kg VC分别来处理PPO粗酶液，处理不同的时间，结果如图4所示。

SO2对PPO的单独抑制效应较温和，当处理时间在10～18 h
时抑制率最强，且它们之间没有显著性差异(P＞0.01)。

VC对PPO的单独抑制效
应较强烈，当处理时间达到8h时具有最大的抑制率，且与第10 h的抑制率没有
显著性差异(P＞0.01)，但从第10 h开始，抑制效果突然开始下降，当处理时间为22h时，抑制率下降到10.29%。

SO2和VC的协同抑制作用如图4所示，当处理时间在12和14 h，复合抑制效
果最佳且它们之间没有显著性差异(P＞0.05)，所以12 h是复合抑制剂的最佳处理时间。

3.2.3 pH值对PPO酶活力的影响
如图5所示，粗酶液分别用pH3.5～4.5的缓冲液处理12 h，随着pH值的增加
抑制率逐渐减少。

最大的抑制率在pH3.5，但由于pH值太低会造成食品过酸因而在食品加工业中很少用。

综合考虑，最终选择pH4.0作为最佳单因素。

3.3 响应面优化结果
利用SAS软件通过二次响应面回归分析对表3中实验数据进行回归拟合，得到多酚氧化酶的酶活力单位对以上4个因素的二次多项回归模型为:
Y=150.6619－8.457547X1－96.61465X2+108.5299X3－
62.83923X4+187.6825X12 +14.26454X1X2－
32.00118X1X3+26.09041X1X4+132.8403X2
2－184.1981X2X3－28.82311X2X4+141.6329X3
2+157.5326X3X4+151.2168X42 (2)
由表4该模型的方差分析表可见，模型具有高度的显著性(P＜0.01)，失拟项(P＞0.10)不显著以及R2=0.9，可知回归方程拟合度和可信度较高，实验误差较小，因而可以用此模型对抑制酶活力的工艺结果进行分析。

其中线性项中X3(pH值)与X2(VC浓度)对PPO酶活力影响最为显著(P＜0.01)，其次是X4(处理时间)(P＜0.05)，X1(SO2浓度)对整体影响效果较小(P＞0.05)。

平方项和交互项都很显著(P＜0.01)。

4个变量的编码值分别为－0.088 7，－0.149 91，－0.848 23和0.642 98时，为最优组合。

通过公式(3)将编码值转化为真实值，确定最优抑制组合为SO2浓度为 0.12 g/kg，VC浓度为 0.2 g/kg，pH 3.83处理时间12.6h，在此抑制组合下 PPO酶活力为92.05 u/(min·g)，抑制率达到96.98%。

式中，M—编码值;xi—编码值对应的真实值;C1，Ci—0，i水平代表的值(其中0和i水平代表的值见表1)。

3.4 验证试验
为检验Box-Behnken试验设计所得结果的可靠性，采用上述优化的工艺参数对
PPO处理后进行酶活力测定，实际测得的平均酶活力单位为92.27(u/min·g)，抑制率达到96.62%，与理论预测值相比，其相对误差约为0.37%。

因此，基于Box －Behnken试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。

(1)香蕉PPO的最适温度为30℃，适宜pH为6.5，具有热不稳定性，当温度达到80℃时活力急剧下降。

(2)在所选抑制剂中，抗坏血酸抑制效果最好，添加范围在0.1～0.5 g/kg时，对PPO酶活力的抑制率达到97.5% ～98.35%，其次是SO2，在添加范围内抑制率可达11.85% ～16.77%，柠檬酸抑制效果最差，只有1.07% ～9.04%
(3)中心组合设计结果为:SO2浓度为0.12 g/kg，VC浓度为0.2 g/kg，酶作用pH 值为3.83，处理时间为12.6 h，此时组合对酶的活性抑制效果最好，抑制率达到96.98%
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