高效液相色谱法hPPT课件
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❖ 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理 论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、 操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱 法优越性，现从两方面进行比较：
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。
❖ 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测器 的有示差折光，电导检测器等。
第三节 固定相和流动相
（－）固定相
❖ 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。
❖ 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～ 1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的 颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合 固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种 固定相。
1、高压输液系统
❖ 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力 很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。
❖ 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。
❖ 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
❖ 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔 型和全多孔型固定相两类。
1.表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔 活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、 聚酸胺等。
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动 相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不 稳，或产生“伪峰”。
（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或 聚合的溶剂。
（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压 力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、 乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、 乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影 响分离.
由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。
2．全多孔型固定相
❖ 它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。如国外的 Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一 厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天 津试剂二厂的DG系列等。
❖ 也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外 的Lichrosorb ALOXT。这类固定相由于颗粒很细 （5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现 高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。 ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。后表列出一些常 用溶剂在氧化铝吸附剂中的ε0值。
在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同，数值可换算（ε0硅 胶=0·77×ε0氧化铝）。
液一液分配色谱法
❖ 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用 于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非 极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型 的化合物。
X + nMad = Xad + nM
达平衡时,有
K ad
[ X ad ][M ]n [ X ][M ad ]n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上 保留强，难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱，易于洗 脱。试样中各组分据此得以分离。 Kad值可通过吸 附等温线数据求出。
固定相
吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的 吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的 优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀， 与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用 得最多。
❖ 用含离子交换基团的固定相，以一定pH含离子的溶液为流动 相，基于离子型组分与固定相离子交换能力差异实现组分分离。
❖ 4.体积排阻色谱
❖ 用化学惰性的多孔凝胶或材料为固定相，按组分分子体积差异， 即分子在固定相孔穴中体积排阻作用差异实现组分分离。
❖ 根据固定相和流动相相对极性的差别，有正相色谱 和反相色谱两种色谱体系。
高效液相色谱仪的结构示意如图，一般可分为 以下几个主要部分：高压输液泵，色谱柱，进样器， 检测器，馏分收集器和处理系统。
其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动 相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出 口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液 器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后 依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信 号记录下来，由此得到液相色谱图。
而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体， 选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固 定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起 很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的 参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效 液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经 典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此 得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应 用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物 质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色 素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严 格，这是它的主要缺点。
为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键 合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合 到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍， 因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可 以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目 前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的 分离问题是在化学键合固定相上进行的。
高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由 于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色 谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1.
例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分 离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即 可完成。
一般色谱柱长530cm内径为45mm凝胶色谱柱内径312mm制备往内径较大可达25mm以上一般在分离前备有一个前置柱前置柱内填充物和分离柱完全一样这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相保证分离技的性能不受影响
第一节 概述
❖ 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪6070年代初发 展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与 发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的 重要手段。
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低 的化合物，它们仅占有机物总数的20％。
对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色 谱法进行分离和分析。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲 和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。
（二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲
和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选 择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的 要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和 良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器， 应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射 通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶 剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收 测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大 差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻 璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如 Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小， 出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容 易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。
第四节 HPLC主要类型
液一固吸附色谱法
液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附 剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存 在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上 的吸附作用不同来进行分离的。
1．分离原理
当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的 活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子 （X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一 定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动 相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:
2、进样系统
❖ 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
❖ 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主 要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。 柱外展宽可分柱前和柱后展宽。
❖ 进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液 相色谱法中对进样技术要求较严。
❖ 高效液相色谱法分类
❖ 1.吸附色谱
❖ 用固体吸附剂为固定相，以不同极性溶剂为流动相，依据试样 各组分在吸附剂上吸附性能差异实现分离。基质上的固定液为固定相，以不同极 性溶剂为流动相，依据试样各组分在固定相中溶解、吸收或吸 着能力差异实现组分分离。
❖ 3.离子交换色谱
3、分离系统-色谱柱
❖ 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定 相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内 衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限， 故金属管用得较多。
❖ 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱 内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上
❖ 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置 柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再
❖ 1．分离原理
液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都 是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同， 具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配 是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行， 造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能 分离各种复杂组分。
固定相
由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相 选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决 分离问题。例如，最常用的强极性固定液β，β′一氧二 丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。
在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可 作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度 小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多 孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全 多孔型微粒填料。
流动相
一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱 中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极 性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。
洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。
❖ 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填
料（＜20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填
料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入 装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
4、 检测系统
❖ 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应，属于这类检测器的 有紫外、荧光、电化学检测器等。
❖ 反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的 相对极性。
❖ 反相色谱中固定相是非极性的，通常是烃类，流动 相是相对极性的水、甲醇、乙腈。
❖ 正相色谱中固定相是极性的，流动相是相对非极性 的正己烷、异丙醚。
❖ 正相色谱中极性最小的组分最先析出，反相色谱中 极性最大的组分最先析出。
第二节 高效液相色谱仪
❖ 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一 定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化 无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱 系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分 机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。
❖ 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测器 的有示差折光，电导检测器等。
第三节 固定相和流动相
（－）固定相
❖ 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。
❖ 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～ 1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的 颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合 固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种 固定相。
1、高压输液系统
❖ 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力 很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。
❖ 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。
❖ 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
❖ 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔 型和全多孔型固定相两类。
1.表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔 活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、 聚酸胺等。
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动 相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不 稳，或产生“伪峰”。
（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或 聚合的溶剂。
（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压 力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、 乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、 乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影 响分离.
由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。
2．全多孔型固定相
❖ 它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。如国外的 Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一 厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天 津试剂二厂的DG系列等。
❖ 也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外 的Lichrosorb ALOXT。这类固定相由于颗粒很细 （5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现 高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。 ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。后表列出一些常 用溶剂在氧化铝吸附剂中的ε0值。
在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同，数值可换算（ε0硅 胶=0·77×ε0氧化铝）。
液一液分配色谱法
❖ 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用 于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非 极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型 的化合物。
X + nMad = Xad + nM
达平衡时,有
K ad
[ X ad ][M ]n [ X ][M ad ]n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上 保留强，难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱，易于洗 脱。试样中各组分据此得以分离。 Kad值可通过吸 附等温线数据求出。
固定相
吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的 吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的 优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀， 与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用 得最多。
❖ 用含离子交换基团的固定相，以一定pH含离子的溶液为流动 相，基于离子型组分与固定相离子交换能力差异实现组分分离。
❖ 4.体积排阻色谱
❖ 用化学惰性的多孔凝胶或材料为固定相，按组分分子体积差异， 即分子在固定相孔穴中体积排阻作用差异实现组分分离。
❖ 根据固定相和流动相相对极性的差别，有正相色谱 和反相色谱两种色谱体系。
高效液相色谱仪的结构示意如图，一般可分为 以下几个主要部分：高压输液泵，色谱柱，进样器， 检测器，馏分收集器和处理系统。
其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动 相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出 口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液 器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后 依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信 号记录下来，由此得到液相色谱图。
而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体， 选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固 定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起 很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的 参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效 液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经 典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此 得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应 用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物 质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色 素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严 格，这是它的主要缺点。
为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键 合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合 到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍， 因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可 以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目 前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的 分离问题是在化学键合固定相上进行的。
高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由 于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色 谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1.
例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分 离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即 可完成。
一般色谱柱长530cm内径为45mm凝胶色谱柱内径312mm制备往内径较大可达25mm以上一般在分离前备有一个前置柱前置柱内填充物和分离柱完全一样这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相保证分离技的性能不受影响
第一节 概述
❖ 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪6070年代初发 展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与 发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的 重要手段。
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低 的化合物，它们仅占有机物总数的20％。
对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色 谱法进行分离和分析。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲 和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。
（二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲
和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选 择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的 要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和 良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器， 应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射 通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶 剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收 测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大 差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻 璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如 Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小， 出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容 易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。
第四节 HPLC主要类型
液一固吸附色谱法
液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附 剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存 在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上 的吸附作用不同来进行分离的。
1．分离原理
当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的 活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子 （X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一 定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动 相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:
2、进样系统
❖ 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
❖ 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主 要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。 柱外展宽可分柱前和柱后展宽。
❖ 进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液 相色谱法中对进样技术要求较严。
❖ 高效液相色谱法分类
❖ 1.吸附色谱
❖ 用固体吸附剂为固定相，以不同极性溶剂为流动相，依据试样 各组分在吸附剂上吸附性能差异实现分离。基质上的固定液为固定相，以不同极 性溶剂为流动相，依据试样各组分在固定相中溶解、吸收或吸 着能力差异实现组分分离。
❖ 3.离子交换色谱
3、分离系统-色谱柱
❖ 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定 相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内 衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限， 故金属管用得较多。
❖ 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱 内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上
❖ 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置 柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再
❖ 1．分离原理
液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都 是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同， 具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配 是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行， 造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能 分离各种复杂组分。
固定相
由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相 选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决 分离问题。例如，最常用的强极性固定液β，β′一氧二 丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。
在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可 作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度 小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多 孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全 多孔型微粒填料。
流动相
一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱 中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极 性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。
洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。
❖ 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填
料（＜20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填
料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入 装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
4、 检测系统
❖ 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应，属于这类检测器的 有紫外、荧光、电化学检测器等。
❖ 反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的 相对极性。
❖ 反相色谱中固定相是非极性的，通常是烃类，流动 相是相对极性的水、甲醇、乙腈。
❖ 正相色谱中固定相是极性的，流动相是相对非极性 的正己烷、异丙醚。
❖ 正相色谱中极性最小的组分最先析出，反相色谱中 极性最大的组分最先析出。
第二节 高效液相色谱仪
❖ 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一 定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化 无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱 系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分 机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。