放射自显影技术

本底过高


妨害自显影中低水平放射性测量，降低 分辨率 造成人工假象，导致解释错误
本底升高的原因



暗室红灯过亮或乳胶在红灯下暴露过长 （不同乳胶对红光耐受性不同） 显影：时间过长，温度过高，显影液配 方不当 周围的放射性污染 感光材料在保存和操作过程中温度过高 （不宜超过40℃），使卤化银发生潜影
光镜ARG


观察范围小，要求分辨率高，以银粒判 断示踪的部位和数量。 适用：组织切片，细胞涂片，培养细胞 意义：研究放射性物质在各种组织或细 胞中的分布情况
光镜放射自显影

体内引入示踪剂 制成切片 涂敷原子核乳胶曝光 显影、定影、水洗、染色 显微镜下观察银粒分布
电镜ARG

3氢－是低能量射线发射体，对生物研究

最有用 14碳 32磷
潜影形成

溴化银
放射物发出 带电粒子
电子
溴原子
被周围银离 子俘获
银原
子（潜影形成）
潜影形成因素

放射源强度 曝光时间 乳胶灵敏度
潜影消退（衰退）


核乳胶中卤化银晶体为带电粒子激发所 形成的潜影的消失 一般认为：由组成潜影的银颗粒的氧化 造成
液态乳胶放射自显影

组织标本制备 固定（Bouim/Carnoy液） 脱水包埋 切片：石蜡4－5u 载玻片：预处理，干净！ 先染或后染：在核乳胶应用前染色称先染； 放射自显影全过程结束后染色称后染。
液态乳胶放射自显影

核乳胶的选择和应用 选择：对β粒子敏感的核乳胶 光镜－核4；电镜－HW4 应用：核乳胶溶解：dH20 1：1稀释 核乳胶涂盖：浸涂法，滴涂法，平涂法 核乳胶干燥：涂后玻片垂直，25℃，70％
放射自显影原理

与光学摄影原理基本相同，有带电粒子 代替光子
放射自显影原理
1、发射电子：核乳胶被发射源带电粒子作 用 负电的卤素离子中释放电子 AgBr＋β Ag＋＋Br＋e－
2、离子对形成 当电离粒子通过溴化银晶体时形成许多 离子对
3、银原子形成 溴离子发出的电子被带正电荷的银离子 所俘获。 e－＋Ag＋ Ag
4、潜影形成 俘获电子的过程，是还原过程，很多带 正电的银离子被还原，在溴化银分子中 形成潜影。
5、显影、定影形成 显影：使形成潜影的卤化银晶体在显影 过程中被还原成银盐颗粒，显出影象 定影：未形成潜影的晶体通过定影而溶 解
生物放射自显影实验的主要程序
1、引入示踪剂：向动物体内或离体标本引 入放射性示踪剂 2、标本制备：标本取材，制成切片或涂片 3、自显影制备：在暗室中在标本上敷加感 光材料 4、曝光：在避光条件下放置，使核射线作 用于乳胶
影响潜影消退的因素

乳胶颗粒直径大小 温度 湿度 银颗粒与空气接触机会愈多，衰退愈快
防止措施


核乳胶储存及曝光过程在低温下进行 自显影在干燥、有CO2或无氧条件下进行 自显影过程长时，最好在惰性气体下进 行（电镜ARG可在真空中进行） 电镜自显影在涂乳胶前先喷碳膜，避免 乳胶直接盖在锇酸固定切片上
液态乳胶放射自显影


标记率＝标记细胞数/增殖区细胞总数 ×100％ 银粒密度：单位面积上银粒计数与单位 面积上的放射性成正比，故银粒密度是 分析和定量的基础。
应用举例




研究药物、营养物质、毒物在器官、组织、细 胞中的分布、运转，以分析其合成、更新、蓄 积作用机理等。 研究特异性标记前体（如胸腺嘧啶核苷作DNA 前体）的渗入部位、特点、影响因素等，探讨 生物活性分子代谢部位机理。 标记抗体或药物在离体标本上显示抗原或受体 位置，作定位示踪。 用于核酸中碱基程序的检测－原位杂交时其探 针用同位素标记。
银晶体φ1μm 单面涂乳胶，片基白色 无防擦伤保护层，对氚接受效率提高
幻灯片（或电影正片）

多用于氚以外各种核素的大体ARG和低 倍显微镜
感光材料的保存


有效期4－6月（过期使用可使本底增高） 避光、防潮、防霉、防热等（黑纸包好， 塑料袋封口，放于4℃冰箱） 从冰箱取出，在室温下打开塑料袋，避 免潮气在袋上凝结
放射性同位素对乳胶作用的特性



α粒子：质量、能量、电离度大，在介质 中运行射程短，自显影分辨率最高 β粒子：质量小，能量不一，速度快，遇 分子碰撞易发生折射，径迹是弯曲的。 低能量的β粒子电离密度大，用于ARG好 γ射线：不带电子的光子流，不影响乳胶， 不能用于ARG
发射β粒子的放射性同位素


观察范围更小，要求分辨率更高，以银 粒判断示踪部位和数量。 适用：细胞学示踪研究 意义：研究放射性物质在亚微结构上的 精确定位
电镜放射自显影

放射性同位素的标记 生物材料的固定、包埋、超薄切片 核子乳胶的应用 显影过程和电子染色
液态乳胶放射自显影

示踪剂的给予 整体动物：1uci/g体重 培养细胞：1uci/ml培养液
照相处理


Βιβλιοθήκη 显影：把已形成潜影的卤化银晶体在显 影过程中被还原成金属银颗粒 定影：把未形成潜影的晶体，通过定影 溶解 水洗：去处显影和定影时各种残留的化 学物质 干燥：大体ARG：空气中干燥 光镜ARG：水洗后染色
影响显影作用的因素

显影时间：平均3分钟，时间延长显象银 粒增加 时间过长－某些未形成潜影的卤化银晶 体也被还原，引起本底增加，分辨率降 低； 时间不足－乳胶表面的卤化银晶体被还 原，深层未起作用，银粒没有足够密度， 反差低，分辨率低
观察范围大，分辨率低，用肉眼或放大 镜观察。由黑度判断示踪部位和数量。 适用：小动物整体标本，大动物脏器、 肢体 意义：研究放射性物质在整个生物体内 的粗略分布
大体放射自显影

引入示踪剂 制成整体切片 与感光片贴合曝光 感光片显影、定影、水洗 肉眼观黑度变化
标本制备注意点



组织切片尽可能薄，太厚会引起周边轮 廓模糊。 组织和感光片接触松紧要适当，以免引 起挤压效应。 防止感光材料上化学污迹。
液体核乳胶


特性：常温－液态；低温－胶冻状 使用前：水溶化－水溶温度40℃为宜 乳胶涂层厚度：10ml/100cm2玻片， 干后厚度50μm 防止张力显影和降低本底：可加入6－甘 醇，铬矾
X片

银晶体φ2.5－3μm 对暗室红光有一定耐受性 乳胶层外涂明胶保护层
氚片

生物放射自显影实验的主要程序
5、照相处理：显影、定影、水洗 6、标本染色、封固、观察
结果：可见放射性示踪剂的分布部位与强 度完全一致的由银粒组成的放射自显影 象
放射自显影的基本知识
感光材料：乳胶（溴化银微晶体、明胶） 显影、定影 射线 乳胶 卤化银感光（潜影形成） 棕黑色金属银颗粒 黑色影象

常用感光材料类型
湿度，30min
液态乳胶放射自显影

自显影：暗盒，4℃，干燥，离放射源远 显影、定影： 显影液：Kodak D19－3min 温度18℃，显影后水洗10s 定影：24－30％硫代硫酸钠－3min－－ 水洗
液态乳胶放射自显影


后染：染液可稀释，要求显示出组织结 构，又反衬出银颗粒 光镜自显影分析 观察：组织与细胞内银粒分布情况 标记百分率 标记组织或细胞内银粒密度
本底升高的原因



压力、张力－涂乳胶时干燥过快，使乳 胶中明胶收缩形成张力显象（标本边缘 和组织间隙） 化学物质污染：有还原性化学物污染使 卤化银还原－化学显象 感光材料过期
常用放射自显影技术方法
放射自显影的分类

大体放射自显影 光学显微镜放射自显影 电镜放射自显影
大体ARG



放射自显影技术
Autoradiography （ARG）
概念
放射性同位素 感光材料 潜影 显影 显象（银粒分布部位及数量） 定影 －－定位、定量
带电粒子
放射自显影优点


定位精确，灵敏度高，分辨率好，能保存相当 长时间 操作简便，无需复杂设备 可供定量研究和双同位素示踪 将形态、机能和代谢地研究统一起来 研究某些大分子在体内地动态变化过程
影响显影作用的因素



显影温度：一般19±1℃ 升高－显影作用增快，使乳胶膨胀，松 软变皱或溶化脱落 过低－在正常显影时间内显影不足 搅动显影液，使显影均匀 显影液新鲜，效力大
自显影本底
除实验标本内组织结构上标记的放射性 以外，由于其他原因所造成的显影银粒 光镜自显影本底控制在： ≤1颗银粒/100μm2

原子核乳胶 X片（包括氚片） 幻灯片（或电影正片）
原子核乳胶

由溴化银和明胶组成的悬液 特点： 1、溴化银晶体细，颗粒数多，颗粒间距小， 大小均匀——自显影分辨率高 2、对红光不太敏感
成品

液体核乳胶－光镜和电镜ARG 核乳胶干板－大体和光镜ARG 原子揭膜乳胶－定量光镜ARG